磷霉素对万古霉素致大鼠肾损害的保护作用及机制研究*

黄丽蓓，杨 斌，黄晓青，林子杰，李洁静，唐生平，丘 岳△

（1.广西医科大学第一附属医院，南宁 530021；2.广西医科大学药学院，南宁 530021；3.广西医科大学第一临床医学院，南宁 530021）

肾毒性是万古霉素的主要副作用。据报道，万古霉素的肾毒性发生率为5%～25%，联用氨基糖苷类药物可高达35%。新的治疗指南建议，使用高剂量（15～20 mg/L）和长疗程万古霉素治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）导致的复杂感染，例如菌血症和医院获得性肺炎，可增加肾损伤（KI）的风险[1-2]。

磷霉素具有广谱抗菌活性，对革兰阳性菌及阴性菌均具有抗菌活性。万古霉素联合磷霉素是临床治疗耐药革兰阳性球菌感染的常用方案。研究显示，磷霉素通过干扰体内炎症因子如肿瘤坏死因子（TNF）-α、白细胞介素（IL）-1β、IL-6水平来调节急性期炎症反应[3]。磷霉素对万古霉素、氨基糖苷类药物、顺铂等药物引起的肾功能损害有保护作用，但其作用机制尚未明确[4-5]。本研究通过建立万古霉素诱导的KI 大鼠模型，探讨磷霉素对万古霉素KI的保护作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 药品与主要试剂 注射用盐酸万古霉素（浙江医药新昌制药厂）；注射用磷霉素钠（东北制药集团沈阳第一制药厂）。丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、一氧化氮（NO）、肌酐（SCr）试剂盒（南京建成生物工程研究所）；尿素氮（BUN）试剂盒（江苏晶美生物科技有限公司）；胱抑素C（Cys C）试剂盒（上海酶联生物科技有限公司）。

1.2 实验动物 成年健康清洁级雄性SD大鼠60只，体重180～220 g，购自广西医科大学实验动物中心，动物生产许可证号：SCXK（桂）2019-0035。大鼠饲养于温度（26±1）℃、湿度85%、清洁级动物实验室内，自由饮水、进食，实验前适应性喂养3 d。

1.3 动物分组与给药 将60 只SD 大鼠随机分为6组，即空白对照组、磷霉素对照组、KI组、KI+磷霉素低剂量组（KI-L 组）、KI+磷霉素中剂量组（KI-M组）、KI+磷霉素高剂量组（KI-H组），每组10只。KI组腹腔注射200 mg/kg万古霉素建立KI模型。KI-L组、KI-M 组、KI-H 组分别腹腔注射125 mg/kg、250 mg/kg、500 mg/kg 磷霉素，30 min 后腹腔注射200 mg/kg 万古霉素，磷霉素对照组仅腹腔注射250 mg/kg磷霉素，空白对照组腹腔注射等量生理盐水，1次/d，连续21 d。

1.4 血清Cys C、BUN、Scr 水平测定 给药结束后24 h，称体重，麻醉，取腹主动脉血，3 000 r/min离心15 min，取上层血清，采用酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测各组大鼠血清中Cys C、BUN、Scr 水平。检测过程严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.5 肾组织病理形态观察 取血后处死大鼠，取双侧肾脏，生理盐水清洗后称重，右肾置于-80 ℃冰箱中保存。将左肾置于10%福尔马林溶液固定24 h，常规脱水，石蜡包埋、切片（厚度为5µm），行苏木精—伊红（HE）染色，显微镜下观察肾组织病理形态变化。

1.6 肾组织SOD、NO 和MDA 水平测定 取右肾组织，用生理盐水制成10%肾匀浆，取上清液，测定SOD、NO和MDA水平。

1.7 统计学方法 采用SPSS 21.0统计软件分析数据，计量资料以均数±标准差（）表示，多组间比较采用方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠血清Cys C、BUN、Scr 水平比较 与空白对照组比较，KI组大鼠血清中Cys C、BUN、Scr水平显著升高（均P＜0.01）；与KI 组比较，KI-L 组和KIM组上述指标均显著降低（P＜0.05）；KI-H组Cys C和Scr水平明显下降（P＜0.05），但BUN无明显差异（P＞0.05）；空白对照组与磷霉素对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 6组大鼠血清中Cys C、Scr、BUN水平比较，n=10

表1 6组大鼠血清中Cys C、Scr、BUN水平比较，n=10

与空白对照组比较，##P＜0.01；与KI 组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

2.2 大鼠肾组织病理形态比较 HE 染色结果显示，空白对照组大鼠肾小管和肾小球形态正常、结构清晰，无异常病理表现；KI 组大鼠肾小管出现不同程度的变性和坏死，肾间质出现严重水肿、大量嗜酸性粒细胞和中性粒细胞浸润，引起肾小管—间质性肾炎；各给药组大鼠肾组织上述形态均有所改善，见图1。

图1 大鼠肾组织HE染色图（×200）

2.3 大鼠肾组织SOD、NO、MDA水平比较

与空白对照组比较，KI 组大鼠肾组织NO、MDA 含量显著升高，SOD 活性降低（均P＜0.01）；与KI组比较，磷霉素各剂量组SOD活性明显升高，KI-M组和KI-H组NO含量明显降低，KI-H组MDA含量明显降低（均P＜0.05），空白对照组与磷霉素对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

表2 6组大鼠肾组织SOD、NO、MDA水平比较，n＝10

表2 6组大鼠肾组织SOD、NO、MDA水平比较，n＝10

与空白对照组比较，##P＜0.01；与KI 组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

3 讨论

急性KI是由各种原因导致的肾单位和间质、血管损伤所致，以肾缺血和肾毒性物质导致的肾小管上皮细胞损伤最为常见。肾毒性物质包括外源性和内源性毒素。外源性肾毒素以药物多见。血清Scr、BUN为临床常规用于监测肾功能的指标，由于肾脏强大的储备和代偿能力，在KI 早期，BUN 和Scr 仍可维持在正常水平。而血Cys C 具有较高的敏感度，且不受个体生理因素和外在条件的影响，是评估肾功能变化的良好指标。文献报道，Cys C可能是评估万古霉素相关肾毒性的理想生物标志物[6-7]。血清Scr与Cys C联合测定对早期KI的预测有较好的应用价值。

万古霉素在近曲小管细胞内积聚引起细胞氧化应激和凋亡是KI发生的可能机制之一，其可能通过间接生成与炎症相关的氧自由基，引起细胞膜脂质过氧化、蛋白质变性及DNA损伤，从而导致肾细胞损伤。万古霉素可通过线粒体活性氧的产生和线粒体心磷脂过氧化诱导猪近端肾小管上皮细胞凋亡[8-10]。SOD 与MDA 分别为评价氧化应激在抗氧化能力和氧化能力方面的重要指标，MDA 含量可反映机体脂质过氧化的程度，间接反映出细胞损伤的程度[11]。本研究中大鼠肾组织SOD活性下降，MDA、NO 含量增多，表明氧化应激途径在万古霉素诱导KI时被激活。

如何降低万古霉素所致的KI，潜在的策略包括延长输液时间、降低最大浓度、给予抗氧化剂、增强药物排泄、重组万古霉素改变肾脏清除机制等[12]。可能对万古霉素致KI有效的药物包括抗氧化剂、转运抑制剂（西司他丁、磷霉素）、溶酶体膜稳定剂（磷霉素）、自噬抑制剂（氯喹、巴丝霉素A1）、mTOR 激活剂等。Jennifer 等[13]在豚鼠KI 组中发现，磷霉素可减轻顺铂引起的急性肾小管坏死和间质性肾炎。磷霉素可抑制庆大霉素诱导的脂质过氧化反应，保护大鼠肾脏溶酶体膜，而对肝线粒体无效[14]。本研究中，KI组大鼠血清Cys C、BUN、Scr水平显著升高，表明成功制作大鼠急性KI 模型；显微镜下可见明显的肾脏病理改变，以肾小管—间质性炎症病变为主。给予磷霉素后，KI 大鼠血清Cys C、Scr、BUN水平均有不同程度地降低，提示磷霉素对万古霉素所致KI有保护作用。磷霉素能显著降低KI大鼠肾组织NO、MDA水平，提高SOD活性，提示磷霉素减轻万古霉素KI 的机制可能与抑制氧化应激状态有关。此外，在本研究中，磷霉素对照组与空白对照组肾功能指标比较无明显差异，表明在正常机能状态下注射磷霉素时，磷霉素并未对大鼠的肾功能产生不良影响。

综上，磷霉素通过增强大鼠体内抗氧化能力，发挥万古霉素KI 的保护作用。但本研究尚未就调控氧化应激上游的具体分子机制进行阐述。本课题组拟进一步研究Keap1-Nrf2/ARE氧化应激信号通路在万古霉素KI 中的作用及磷霉素的保护机制。此外，免疫介导机制也可能参与了万古霉素诱导的KI，磷霉素也有免疫调节作用，免疫机制在磷霉素对万古霉素KI 的保护作用机制亦值得进一步探讨。