NLRC5在大鼠腰椎椎板切除术后硬膜外瘢痕形成中的作用

吴 积，靳 桢，谢 浩，王彬彬，覃 健，刘 军

1.南京医科大学附属逸夫医院骨科，南京 211100

2.南京医科大学研究生院，南京 211166

3.南京医科大学第二附属医院骨科，南京 211100

硬膜外瘢痕形成是椎板切除术的常见并发症，易引起术后复发性疼痛，如何预防或减少椎板切除术后硬膜外瘢痕形成是目前骨科研究的热点之一［1-2］。NLRC5是高度保守的核苷酸结合寡聚化结构域样受体（NLR）家族成员之一，有研究［3-6］表明其参与肝纤维化、皮肤纤维化等的发展过程，可能是治疗瘢痕形成的一个理想靶点。本研究初步探讨NLRC5在大鼠硬膜外瘢痕形成的表达与作用，为预防或减少椎板切除术后硬膜外瘢痕形成提供思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物

60只雄性SD大鼠（3月龄，体质量约400 g）购自南京医科大学实验动物中心，饲养在无特定病原体（SPF）环境中。在实验过程中，控制温度（22±2）℃、光照（早上7点至晚上7点）及相对湿度为（50±5）%。所有实验程序均在南京医科大学动物保护与使用机构委员会（IACUC）的批准和监督下进行。

1.2 动物模型制备

实验大鼠正常饮水进食，随机分为手术组（n=30）和假手术组（n=30），适应性饲养1周后，按照每400 g体质量注射1.0 mL 2%戊巴比妥钠进行腹腔麻醉，俯卧位固定。在L1棘突水平做后正中切口，剥离两侧竖脊肌，显露L1~3椎板。手术组切除L1~2全椎板，暴露硬膜，彻底止血；假手术组不做任何特殊处理。之后将切口层层缝合。术后大鼠单独分笼饲养，允许正常活动。

1.3 硬膜外瘢痕纤维化评估

术后4周，每组随机选取6只大鼠进行肉眼观察。重新开放手术切口，根据Rydell标准［7］评估硬膜外瘢痕纤维化程度：0级，瘢痕组织少，不粘连硬膜；1级，瘢痕组织轻度粘连硬膜；2级，瘢痕组织紧密粘连硬膜，难以分离；3级，瘢痕组织牢固粘连硬膜，不能解剖。

1.4 Masson染色

术后4周，每组随机选取6只大鼠，处死后取硬膜外组织标本，将标本于10%中性甲醛溶液中固定，经脱水、透明、石蜡包埋、切片后作Masson染色，置于光镜下观察硬膜外组织病理学变化。

1.5 实时荧光定量PCR法检测mRNA表达水平

术后4周，每组随机选取6只大鼠，处死后取硬膜外组织标本，采用TRIzol试剂（赛默飞世尔科技公司，中国）提取组织总RNA，取2 µg RNA进行逆转录，根据逆转录试剂盒（爱必梦生物科技有限公司，中国）说明进行操作。以逆转录得到的cDNA作为模板，进行实时荧光定量PCR检测。引物序列：β-actin上游引物5′-CCCATCTGAGGGTTACGC-3′，下游 引 物5′-TTTAATGTCACGACGATTTC-3′；NLRC5上游引物5'-CGCTCTGTGGCCACTTTCAG-3′，下游引 物5′-TGCCCGCTGTGAGACTTCAT-3′；α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）上游引物5′-GAGCGTGGCTATT CCTTCGTG-3′，下游引物5′-CAGTGGCCATCTCATTT TCAAAGT-3′；结缔组织生长因子（CTGF）上游引物5′-GGCAGGGCCAACCACTGTGC-3′，下游引物5′-CA GTGCACTTGCCTGGATGG-3′；Ⅰ型胶原（COLⅠ）上游引物5′-TACAGCACGCTTGTGGAGATG-3′，下游引物5′-TTGAGTTTGGGTTGTTGGTC-3′。PCR引 物 由 南京金斯瑞生物科技有限公司合成。以β-actin为内参照，采用2-ΔΔCt法分析NLRC5、α-SMA、CTGF、COLⅠ的mRNA表达量。

1.6 蛋白质印迹法检测蛋白表达水平

术后4周，每组随机选取6只大鼠，处死后取硬膜外组织标本，用RIPA裂解缓冲液提取硬膜外组织总蛋白，BCA法测定总蛋白浓度，计算上样量，配制分离胶与浓缩胶进行电泳。电泳结束后，将蛋白条带转印至PVDF膜上，用5%脱脂奶粉室温封闭1 h，经PBS洗涤后加入β-actin抗体（8H10D10，CST，美国）、NLRC5抗体（sc-515668，Santa Cruz Biotechnology，美国）、α-SMA抗体（ab32575，Abcam，英国）和CTGF抗体（ab6992，Abcam，美国），工作浓度均为1∶1 000，于4℃孵育过夜。取出后用TBST洗涤，加入相应二抗（工作浓度1∶10 000），摇床孵育1 h，TBST洗涤。用化学发光法进行曝光并拍照保存，采用Image J软件对条带的灰度值进行分析，以β-actin为内参照计算目的蛋白的相对表达量。

1.7 ELISA检测COLⅠ含量

术后4周，每组随机选取6只大鼠，处死后取硬膜外组织标本，匀浆后取上清液，严格按照COLⅠ ELISA试剂盒（北京龙天科技有限公司，中国）使用说明书检测上清液中COLⅠ含量。

1.8 统计学处理

采用SPSS 23.0软件对数据进行统计分析，计量资料以±s表示，组间比较采用独立样本t检验；以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 大鼠模型建立和大体观评价

动物模型建立4周后，假手术组大鼠未发现瘢痕组织，Rydell瘢痕纤维化评估均为0级；手术组硬膜外瘢痕组织增生，Rydell瘢痕纤维化评估1级2只、2级4只（图1）。

图1 大鼠腰椎椎板切除术后硬膜外瘢痕Fig. 1 Epidural scar formation after lumbar laminectomy in rats

2.2 大鼠硬膜外组织Masson染色

Masson染色显示，假手术组大鼠硬膜外组织结构完整，界限清晰，无异常纤维增生；手术组大鼠硬膜外组织结构破坏，可见大量纤维细胞（图2）。

图2 2组大鼠硬膜外组织Masson染色（×400）Fig. 2 Masson staining of epidural tissues in 2 groups of rats（×400）

2.3 NLRC5在大鼠硬膜外组织中的表达

实时荧光定量PCR检测结果显示，手术组大鼠硬膜外组织NLRC5、CTGF、α-SMA和COLⅠ的mRNA表达水平均高于假手术组，差异有统计学意义（P＜0.05，图3）。蛋白质印迹法检测结果显示，手术组大鼠硬膜外组织NLRC5、CTGF、α-SMA的蛋白表达水平均高于假手术组，差异有统计学意义（P＜0.05，图4）。ELISA法检测结果显示，手术组大鼠硬膜外组织中COLⅠ含量高于假手术组，差异有统计学意义（P＜0.05，图5）。

图3 实时荧光定量PCR检测2组大鼠硬膜外组织中 NLRC5、CTGF、α-SMA 和 COLⅠ的mRNA的表达Fig. 3 Expressions of NLRC5，CTGF，α-SMA and COLⅠ mRNA of epidural tissues in 2 groups of rats detected by real-time quantitative PCR

图4 蛋白质印迹法检测2组大鼠硬膜外组织中 NLRC5、CTGF、α-SMA的蛋白表达Fig. 4 Expressions of NLRC5，CTGF and α-SMA protein of epidural tissues in 2 groups of rats detected by Western blotting

图5 ELISA法检测2组大鼠硬膜外组织中COLⅠ的含量Fig. 5 Content of COLⅠ of epidural tissues in 2 groups of rats detected by ELISA

3 讨 论

椎板切除术后硬膜外瘢痕形成具体的发生机制尚不明确，与血肿形成、炎性细胞因子积累、成纤维细胞增殖和胶原合成等多种因素加速手术创伤后硬膜外手术区纤维粘连的形成有关。椎板切除术后，硬膜外组织在各种免疫细胞因子刺激下，成纤维细胞趋向于广泛增殖，产生胶原，释放细胞外基质，最终导致硬膜外瘢痕粘连的形成［8-9］。除了通过改进术式减少损伤外，目前应用于术后瘢痕防治的方法主要包括药物防治和人工材料防治，例如五味子提取物［1］、丝裂霉素C［10-11］、新型防粘膜E8004［12］、生物蛋白胶［13］等。多数药物作用时间较短，长期使用副作用大，而人工材料在体内作为异物远期疗效欠佳，都有一定的局限性，国内外学者仍在探索更好的高分子材料及药物来防治硬膜外瘢痕形成［14］。目前，抑制参与胶原蛋白过度合成和细胞增殖因素是治疗硬膜外瘢痕粘连的一种策略。

近期有学者发现NLRC5可能是治疗瘢痕的新靶点，沉默NLRC5可通过抑制TGF-β1/Smad信号通路减少细胞外基质过度表达，抑制瘢痕形成的表型和标志物 CTGF、α-SMA和COLⅠ的表达［6］。NLR是一组细胞内蛋白，介导对病原体相关分子模式或其他胞质危险信号的识别［15-17］。NLRC5是高度保守的NLR家族成员之一，主要在骨髓和淋巴谱系细胞中表达，能够有效抑制机体的天然免疫和炎性反应［18］。有研究［19］发现，NLRC5在人纤维化肝脏组织及CCl4诱导的小鼠肝纤维化组织中表达量均升高，而抑制NLRC5的表达可明显抑制肝星状细胞的活化增殖，提示NLRC5可能与肝纤维化形成有关。

目前NLRC5在硬膜外瘢痕组织的表达及作用尚不清楚。本研究结果表明，大鼠椎板切除术后4周发生了明显的硬膜外瘢痕形成，且手术组NLRC5、CTGF、α-SMA和COLⅠ的mRNA表达较假手术组增高，NLRC5、CTGF和α-SMA的蛋白表达和COLⅠ含量也较假手术组增高，提示NLRC5可能参与椎板切除术后硬膜外瘢痕形成的过程，但具体的分子机制仍有待于后期研究进一步阐明。本研究为研究预防硬膜外瘢痕形成的治疗靶点提供了新的思路。