烟草尖孢镰刀菌拮抗真菌的筛选鉴定及促生作用研究

姚晨虓，李小杰，李 琦，邱 睿，白静科，刘 畅，陈玉国，康业斌，李淑君*

（1. 河南科技大学园艺与植物保护学院，洛阳 471023；2. 烟草行业黄淮烟区烟草病虫害绿色防控重点实验室/河南省农业科学院烟草研究所，许昌 461000；3. 中国烟草总公司河南省公司，郑州 450018）

近年来，烟草镰刀菌根腐病在我国烟区的发病范围和发病程度逐步上升[1-3]，在云南[4]、贵州[5]、河南[6]的部分县（区）发生严重；在希腊[7]、西班牙[8]、马来西亚[9]等国家也均有发生。据报道，引起根腐病的镰刀菌种类很多，而主要致病菌是尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum和茄病镰刀菌F. solani[10]。镰刀菌既可单独侵染，又可与烟草疫霉、根结线虫等混合侵染，造成烟株死亡，烟叶大幅减产，甚至绝收，已成为严重危害烟草的根茎类病害之一[11]。

目前，以生物农药为主的烟草病害生物防治技术的研究与应用已成为热点，对烟草行业的绿色可持续发展具有重要意义。刘畅等[12]研究了哈茨木霉YCG-2对烟草黑胫病具有较强的拮抗作用。陈小均等[5]报道木霉菌肥对土壤优势真菌和烟草茄病镰刀菌有较好的防病和治疗作用。田艳艳等[13]报道哈茨木霉和棘孢木霉对烟草疫霉、瓜果腐霉和尖孢镰刀菌均有一定的抑制作用。姚晓远等[14]报道了哈茨木霉对烟草茄病镰刀菌有较好的防治效果。但对烟草尖孢镰刀菌拮抗真菌的系统筛选及其作用机制的研究报道较少。

因此，本研究通过对植物根际土壤微生物的分离、筛选，获得对烟草尖孢镰刀菌具有较好抑制作用的拮抗真菌菌株，明确其种类，并测定其对烟草的促生效果，为进一步研制高效生防菌剂和生物菌肥奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 供试土样 2020年分别选取许昌、漯河、平顶山等豫中烟区，在烟草团棵期至旺长期采集烟田及其邻近田块植株根际土壤。

1.1.2 供试菌株和烟草品种 供试烟草病原菌由河南省农业科学院烟草研究所菌源库提供；烟草品种为“中烟100”（中抗）[10]，由河南省农业科学院烟草研究所种质资源库提供。

1.1.3 培养基及培养条件 土壤真菌分离纯化采用马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA），在相对湿度70%，25 ℃光周期12L﹕12D的培养箱中培养1～5 d，将纯化的菌株于4 ℃冰箱保存备用。

1.2 试验方法

1.2.1 拮抗真菌分离纯化 将取回的根际土壤样品自然风干并挑除杂物，过筛后用四分法收集。采用梯度稀释涂布平板法，用无菌水制成10-1、10-2、10-3的土壤悬浮液，分别取100 μL均匀涂布在PDA培养基上培养真菌菌落，挑取不同形态、颜色、大小的菌落进行纯化保存。

1.2.2 拮抗真菌的筛选 以烟草尖孢镰刀菌为靶标，在活化好的菌落外围打取直径5 mm菌饼，采用平板对峙培养法和菌丝生长速率法[13]在距离PDA平板中心2.5 cm的相对2点上分别接种纯化待测真菌和病原菌，以只接病原菌为对照，重复3次。倒置放入25 ℃恒温光照箱培养6～8 d后采用十字交叉法测量菌丝半径，计算菌丝生长抑制率[13]。以距中心2.5 cm的相对2点上接种待测真菌，中心位置接种病原菌进行复筛，其他方法同上并计算抑制率，抑制率（%）＝（对照菌落直径－处理菌落直径）/（对照菌落直径－菌饼直径）×100。

真菌拮抗系数分级标准[15]：Ⅰ级：待测真菌菌丝平板覆盖率 100%；Ⅱ级：待测真菌菌丝平板覆盖率2/3以上；Ⅲ级：待测真菌菌丝平板覆盖率1/3～2/3；Ⅳ级：待测真菌菌丝平板覆盖率1/3以下；Ⅴ级：病原菌丝平板覆盖率100%。

1.2.3 拮抗真菌的鉴定 选取已纯化的待测菌株，制作不同生长时期的水玻片，在光学显微镜下观察其菌丝形态、产孢方式和子实体的形态、大小、颜色，根据观察到的形态特征参照《真菌鉴定手册》[16]等相关文献资料，初步确定菌株的分类地位。

参照文献方法[17]使用 Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒（上海生工），提取待测菌株的基因组DNA，应用真菌鉴定通用引物 ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和 ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGA TATGC-3′）进行 PCR 扩增。PCR 扩增体系（25 μL）：DNA 模板 1 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各 1 μL，2×PCRTaqMasterMix 12.5 μL，加双蒸水至25 μL。PCR反应条件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，28个循环；72 ℃ 8 min，将扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳，胶回收后送至上海英潍捷基贸易有限公司完成测序。应用NCBI（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）进行序列比对分析，采用MEGA软件的Neighbor-Joining法构建系统发育树。

1.2.4 拮抗菌株的抑菌谱测定 方法同 1.2.2，测定所鉴定菌株对烟草茄病镰刀菌F. solani、疫霉菌Phytophthora nicotianae、根串珠霉菌Thielaviopsis basicola、链格孢菌Alternaria alternata、拟茎点霉Phomopsissp.、烟草炭疽菌Colletotrichum nicotianae、立枯丝核菌Rhizoctonia solani、葡萄座腔菌Botryosphaeria dothide8种烟草病害的抑制效果。

1.2.5 拮抗菌株对烟草种子萌发及促生作用测定 采用培养皿滤纸保湿法[17]，将“中烟100”种子依次用75%的乙醇和0.5%的次氯酸钠消毒30 s，无菌水漂洗干净后放入拮抗菌孢子悬浮液（浓度为 1×107孢子/mL）中浸种16 h，再用无菌水漂洗3～4次，晾干，将种子整齐摆放在无菌脱脂棉和滤纸保湿的培养皿中，以无菌水浸泡同等时间的消毒种子作为对照，每皿25粒种子（5×5），重复3次，第13 d测量统计种子萌发率及烟苗根长，计算增长率，增长率（%）＝（处理组根系长度－对照组根系长度）对照组根系长度×100。

1.2.6 拮抗菌株对烟草盆栽促生作用测定 采用室内盆栽试验法[17]并略有改动，将未经处理的“中烟100”种子培育至4～5片真叶期，将灭菌的基质和土均匀混合（质量比2:1）、拌至湿度适宜，每个盆钵（口径9.3 cm，底径7.0 cm，盆高7.5 cm）中装（180±2.5）g基质土，挑选大小均一的烟苗移栽至盆钵中，将培养好的拮抗菌发酵液（挑取12个活化培养好的5 mm拮抗菌菌柄，在无菌环境下转接至装有200 mL液体PDA培养基的500 mL三角瓶中，28 ℃、180 r/min振荡培养7 d制成）稀释至1×107孢子/mL的浓度，按每株20 mL进行灌根处理，每处理10株盆栽，重复3次，以等体积无菌水灌根处理为对照，期间保证水肥管理统一，第25 d根据中华人民共和国烟草行业标准（YC/T142-2010）中的农艺性状测量方法测定其对农艺性状的影响，测量指标包括烟株的株高、茎围、有效叶片数、最大叶长、最大叶宽、地上鲜重和根系鲜重，并利用下列公式计算最大叶的叶面积，叶面积（cm2）＝0.6345×叶长（cm）×叶宽（cm）。

1.3 数据统计与分析

采用DPS 7.05 软件进行差异显著性检验，采用Duncan新复极差法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 拮抗真菌的分离筛选

分离纯化真菌菌株371株。通过平板对峙培养法获得1株对尖孢镰刀菌具有明显抑制效果的真菌菌株（图1），编号为Tr-0111，初筛抑制率为76.12%，拮抗系数为Ⅱ级；复筛抑制率为93.13%，拮抗系数为Ⅱ级（表1）。

图1 菌株Tr-0111对尖孢镰刀菌的PDA平板抑制作用Fig. 1 The inhibitory effect of strain Tr-0111 on PDA plate of F. oxysporum

表1 菌株Tr-0111对尖孢镰刀菌的抑制作用Table 1 The inhibitory effect of strain Tr-0111 on F. oxysporum

2.2 拮抗菌株的鉴定

2.2.1 形态学鉴定 菌株Tr-0111菌落初期为白色，中心浅绿色，气生菌丝纤细、羊毛状，由中心向四周散布，菌落背面无色。菌落中期逐渐转变为浅绿色，中心呈深绿色，气生菌丝转变为棉絮状。菌落后期整体呈深绿色，棉絮状菌丝减少，菌落背面浅绿色至绿色（图2）。分生孢子梗主枝呈树状，含多级分枝，各级分枝的顶端形成 3个簇生的小梗，分生孢子呈球形、椭球形或卵形，浅绿色，初步鉴定为木霉属Trichodermaspp.[16]真菌（图3）。

图2 菌株Tr-0111在PDA培养基上1～6 d (a-f)的菌落形态Fig. 2 Colonial morphology of strain Tr-0111 on PDA medium for 1-6 d (a-f)

图3 菌株Tr-0111的显微形态Fig. 3 Microscopic morphology of strain Tr-0111

2.2.2 分子生物学鉴定 将菌株 Tr-0111的 ITS序列进行 PCR扩增，获得大小为 577 bp的特异性条带（GenBank登录号：MZ 818342），在GenBank数据库中进行Blast比对分析，发现菌株Tr-0111与棘孢木霉菌相似性可达100%。运用邻接法构建该菌株的18S rDNA序列系统发育树（图4），结果表明该菌株与棘孢木霉菌（MN093873.1、MT102261.1、MG786721.1）以 100%自举值聚于同一分支。结合形态学鉴定结果，将菌株Tr-0111鉴定为棘孢木霉T. asperellum。

图4 菌株Tr-0111的18S rDNA序列系统发育树Fig. 4 The phylogenetic tree of strain Tr-0111 18S rDNA sequence

2.3 拮抗菌株对烟草病原的抑菌谱

抑菌谱测定结果表明，菌株Tr-0111对其他8种烟草病害的病原菌均有不同程度的抑制作用（图5）。其中对根串珠霉菌的抑制效果最为显著，抑制率为90.11%，拮抗系数为Ⅰ级；对立枯丝核菌的抑制作用相对较弱，抑制率也达42.67%，拮抗系数为Ⅲ级（表2）。表明菌株Tr-0111对烟草病原菌的防治具有非常好的广谱性。

表2 菌株Tr-0111对常见烟草病原菌的抑制作用Table 2 The inhibitory effect of strain Tr-0111 on common tobacco pathogens

2.4 拮抗菌株对烟草种子萌发及促生作用

试验结果表明，菌株Tr-0111孢子悬浮液处理过的种子与无菌水处理过的对照组种子相比，萌发率提高了5.34%，处理组种子萌发率可达90.67%，且存在显著性差异（表3）。处理组的烟苗根系发育较好，长势一致且根长明显长于对照组，烟苗根长增长率为62.39%，存在极显著差异水平（图6）。

表3 菌株Tr-0111孢子悬浮液对烟草种子萌发和根系发育的影响Table 3 Effects of spore suspension of strain Tr-0111 on tobacco seed germination and root development

2.5 拮抗菌株对烟草盆栽促生作用

盆栽试验结果表明，菌株Tr-0111发酵液灌根的烟苗与对照组烟苗在农艺性状的各项指标中均存在一定的差异，处理组的烟草长势一致，枝叶繁茂，根系发达，整体促生效果良好，尤其在最大叶面积和地上鲜重部分，最大叶面积增加了55.13 cm2，地上鲜重增加了9.49 g，两者均与对照组存在显著差异（表4）。

表4 菌株Tr-0111发酵液对盆栽烟草的促生效果Table 4 Growth-promoting effect of fermentation broth of strain Tr-0111 on potted tobacco

3 讨论

烟草镰刀菌根腐病的化学防治不仅对非靶标生物有害且存在残留问题，农业防治费时费力，而生物防治可以极大程度上降低化学药剂用量且不会损害到非靶标生物[18-20]。木霉属真菌是研究最多、应用最广的一类生防真菌，具有极高的生防价值[21]。目前，关于棘孢木霉在不同作物上的防病效果和促生作用也常有报道。刘畅等[22]报道棘孢木霉CBS 433.97对尖孢镰刀菌MC-1（苦瓜枯萎病病原菌）和CS-5（黄瓜枯萎病病原菌）的抑制率分别为36.4%和62.0%；郑柯斌等[23]报道了海洋生境棘孢木霉TCS007对16种植物病原菌的抑制率在56.65%～87.62%。而本研究筛选鉴定的棘孢木霉Tr-0111对烟草尖孢镰刀菌的抑制效果明显更强，对烟草茄病镰刀菌和其他常见病原菌均有极好的抑制效果，同样也证实了棘孢木霉具有极好的广谱性。平板对峙试验结果表明，烟草尖孢镰刀菌的平板抑制效果与棘孢木霉 Tr-0111的接种量成正相关，复筛抑菌率较初筛抑菌率提高了17.01%，最高可达93.13%，对于盆栽防效和田间试验而言，可通过调节生防菌剂的施用量以期达到最佳的防治效果，具有较高的生防潜力和应用价值。

自1998年桑维钧等[24]首次报道我国烟草镰刀菌根腐病以来，相关研究较少，尤其对烟草病害生防菌的促生作用更是鲜有报道[5,13,14,25]。本研究采用培养皿滤纸保湿法测定了棘孢木霉Tr-0111处理过的烟草种子萌发率和根系生长均显著提高，操作方便快捷，影响因素单一，直观的筛选并反映了对烟草尖孢镰刀菌具有极好的抑制作用，兼具促生效果的高效拮抗菌株，对生产上抗性品种的诱导选育、包衣剂的开发具有很好的应用前景。

张晓梦等[26]发现棘孢木霉 M2对 8种植物病原菌均有较好的抑制能力，并且可以促进植物生长；Yu等[27]报道棘孢木霉TaspHu1孢子悬浮液处理的番茄幼苗的株高、茎围、可溶性蛋白含量和可溶性糖含量均明显增高，同时增强了番茄幼苗对链格孢的抗性。本研究也证实了棘孢木霉Tr-0111的发酵液对烟草幼苗的各项农艺性状指标有明显的提升，对于植株本身抗性酶活和不同激素水平的影响需要进一步验证，并继续挖掘其促生原理和抗病机制。

本研究通过大量分离、筛选，鉴定出一种对烟草尖孢镰刀菌具有较强抑制作用，抑菌谱广，且能促进烟草种子萌发和植株生长的棘孢木霉 Tr-0111，具有极好的研究价值和生防应用潜力，为下一步的相关研究和生产应用工作的开展奠定基础。