短小芽孢杆菌HN-10抗菌肽P-1对粉红单端孢细胞膜结构和活性氧代谢的影响

武淑娟,贠建民,王睿,何奎,毛永强,赵风云,张紊玮,艾对元

(甘肃农业大学 食品科学与工程学院,甘肃 兰州,730070)

粉红单端孢(Trichotheciumroseum)是引起果蔬采后病害的重要病原物[1],它不仅能够侵染果蔬产品,造成严重的经济损失,而且产生的次级代谢产物单端孢霉烯毒素具有生物毒性[2]。目前,控制由T.roseum引起的果蔬采后病害主要依赖于化学合成的杀真菌剂[3],但是化学合成杀菌剂的长期使用,易引起药物残留,污染环境并影响人类健康,甚至增加病原体的抗药性[4]。因此,选择替代或减少化学合成杀菌剂,研究相应的抑菌物质具有重大意义[5]。

抗菌肽又名抗微生物肽[6],是一类小分子的多肽类物质,具有抗真菌的生物学特性且不易产生耐药性,有望成为化学药物替代品,应用潜力和价值巨大[7]。实验室前期从腐败的湿粉条中分离得到了1株对粉红单端孢具有拮抗作用的芽孢杆菌,经鉴定为短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus) HN-10,利用B.pumilusHN-10发酵液开展了拮抗实验研究[8]；严海娇等[9-10]通过硫酸铵沉淀、AB-8大孔吸附树脂、Sephadex G-100凝胶和半制备型反相高效液相色谱法对B.pumilusHN-10发酵液进行逐级分离纯化,获得了抗真菌肽P-1,并证实了B.pumilusHN-10抗菌肽P-1仅对粉红单端孢具有抑菌作用;明确了其氨基酸序列和分子质量,分别是GGSGGGSSGGSIGGR和1 149.14 Da；郭娟等[11]采用转录组学和蛋白组学初步分析了抗菌肽P-1对粉红单端孢胞内核酸,以及蛋白质的影响,但尚未明确其抑菌机理。

本试验以粉红单端孢为供试菌,基于平板培养和液态培养体系,采用碘化丙啶(propidiumiodide,PI)染色和透射电镜技术观察、结合系列生理生化指标测定,从细胞壁、膜结构变化、膜通透性以及膜脂过氧化等方面,探讨B.pumilusHN-10抗菌肽P-1处理对粉红单端孢细胞膜结构和活性氧(reactive oxygen species,ROS)代谢的影响,以期阐明抗菌肽P-1的抑制作用机理,为红粉病害控制及新型生防治剂的开发应用提供理论依据和支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料：抗菌肽P-1,分离纯化于短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus) HN-10。

试验菌株：粉红单端孢(Trichotheciumroseum)CICC 2703,中国工业微生物菌种保藏中心。

1.2 试验方法

1.2.1B.pumilusHN-10抗菌肽P-1的粗提和分离纯化

参照严海娇等[9]的方法测定。

1.2.2T.roseum孢子悬浮液制备

参照刘志恬等[12]的方法制备。

1.2.3 抗菌肽P-1抑菌效果的测定

采用牛津杯法进行抑菌实验。在PDA平板中央滴1滴(约2 μL),1×108个/mL的T.roseum孢子悬浮液,然后在孢子悬浮液等距2 cm处放置4个牛津杯,吸取抗菌肽P-1 1 μL滴加于牛津杯中,等量无菌蒸馏水做为空白对照,置于28 ℃培养箱中培养7 d,采用十字交叉法测定抑菌直径。实验设3个重复。

1.2.4 抗菌肽P-1对T.roseum孢子细胞膜完整性和超微结构的影响

细胞膜完整性采用PI染色检测,具体参照WANG等[13]的方法测定,其超微结构变化参照HELAL等[14]的方法进行测定。

1.2.5 抗菌肽P-1对T.roseum菌体生长曲线的测定

在150 mL PDA 液体培养基中接种120 μL密度为1×108个/mL的孢子悬浮液和1 μg/mL的抗菌肽P-1,28 ℃,200 r/min 培养0、1、3、5、7 d,10 000 r/min离心20 min分别收集菌丝,80 ℃ 烘干至恒重,称量质量。每组重复3次。

1.2.6 抗菌肽P-1对T.roseum菌体细胞膜上麦角甾醇含量的影响

参考LIU等[15]的方法进行测定。

1.2.7 抗菌肽P-1对T.roseum细胞膜通透性的影响

细胞外膜通透性参照付永岩等[16]的方法进行测定；电导率参照王雪燕等[17]的方法；脂质过氧化参照PUSHPANATHAN等[18]的方法；蛋白羰基化参照段丽菊等[19]的方法；丙二醛(malondialdehyole,MDA)含量参照王霆等[20]的方法。

1.2.8 抗菌肽P-1对T.roseum菌体活性氧代谢的影响

1.3 数据分析和处理

全部数据用Excel 2010计算平均值和标准偏差,使用Origin 9.0软件作图。用SPSS 19.0进行差异显著性分析及相关性分析(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 B.pumilus HN-10抗菌肽P-1的纯化

由表1可知,B.pumilusHN-10抗菌肽P-1经过硫酸铵沉淀、AB-8大孔吸附树脂、Sephadex G-100凝胶进行了分级纯化,最终得到了抗菌肽P-1。结果显示,经过逐级纯化的抗菌肽P-1对粉红单端孢具有明显的抑菌作用。

表1 不同纯化方式对粉红单端孢的抑菌活性Table 1 Antifungal activity of different purification methods against T.roseum

2.2 抗菌肽P-1抑菌效果的测定

抗菌肽P-1对T.roseum的抑菌作用如图1,抗菌肽P-1对粉红单端孢菌体生长具有明显抑制作用,抑菌圈直径达到(12.1±0.10) mm。

1-加入抗菌肽P-1；CK-对照图1 抗菌肽P-1对T.roseum的抑制效果Fig.1 Inhibitory effect of antifungal peptide P-1 on T.roseum

2.3 PI检测抗菌肽P-1对T.roseum孢子细胞膜完整性的影响

PI为非膜渗透性荧光染料,可以染色细胞核,质膜完整的细胞中,PI无法正常进入细胞,因而可以利用这一性质观察细胞核是否被染色,若能观察到荧光则证明质膜不完整。在荧光显微镜下观察,正常的细胞不能被染上红色,只有细胞膜被破坏的细胞才能发出红色荧光,并且早期凋亡的细胞红光比较微弱,晚期凋亡的细胞红光变强[22]。由图2可知,处理组中随着抗菌肽P-1时间的延长,被PI染色的孢子数逐渐增多(图2-d～图2-f),处理组可观察到明显荧光,而对照组(图2-a～图2-c)几乎无荧光。由此说明抗菌肽P-1破坏了T.roseum孢子的细胞膜完整性。

a-对照4 h；b-对照8 h；c-对照-12 h；d-处理4 h；e-处理8 h；f-处理12 h图2 抗菌肽P-1对T.roseum孢子质膜完整性的影响Fig.2 Effect of antifungal peptide P-1 on plasma membrane integrity of T.roseum spores

2.4 抗菌肽P-1对T.roseum孢子超微结构的影响

为了进一步验证抗菌肽P-1对T.roseum孢子的破坏作用,通过透射电镜观察正常菌体及被抗菌肽P-1处理的菌体细胞形态、细胞壁、膜及细胞器的变化情况,从细胞水平分析抗菌肽P-1对菌体的影响[23]。对照组孢子结构完整且紧密,壁、膜平滑完整,胞内横隔膜完整且细胞器分布均匀(图3-a)。抗菌肽P-1处理4 h后,有些菌体壁、膜边缘变得粗糙不平,甚至出现局部的破损缺口(图3-b)。处理8 h时,菌体内横隔膜内陷断裂细胞壁薄厚不均甚至残缺,细胞质外渗出现电子密度高的阴影,细胞器分布紊乱(图3-c)。延长处理时间至12 h时,观察到细胞器不规则且模糊,细胞质内含物大多消失,细胞质大量外渗,孢子变形(图3-d)。由此可知,抗菌肽P-1处理破坏了T.roseum菌体的超微结构,且处理时间越长,破坏越严重。

Cw-细胞壁;Cm-细胞膜;Cy-细胞质a-对照0 h(×18 000)；b-处理4 h(×25 000)；c-处理8 h(×21 000)；d-处理12 h(×21 000)图3 抗菌肽P-1对T.roseum孢子超微结构的影响Fig.3 Effect of antifungal peptide P-1 on ultrastructure of T.roseum spores注：a-×18 000；b-×25 000；c、d-×21 000

2.5 抗菌肽P-1对T.roseum菌体生物量和细胞膜麦角甾醇含量的影响

菌体生物量如图4-a,对照组的T.roseum生长良好,具有典型微生物的生长曲线特征,在第5天进入稳定期,第7天时达到最大生物量为0.171 g。而处理组生长曲线位于对照组下方,生长曲线呈现为平缓的下降趋势。结果说明抗菌肽P-1能够明显抑制T.roseum的生长繁殖。

麦角甾醇是真菌细胞膜的重要组分,主要以自由态的形式存在于磷脂双分子层中,在维持细胞膜流动性方面起着重要的作用[24]。麦角甾醇的缺失或降低,会导致真菌细胞膜结构破坏及功能的丧失[25]。因此,麦角甾醇含量的变化是衡量细胞膜受损的主要指标。由图4-b可知,随着时间的延长,麦角甾醇含量呈下降趋势,且在每个时段,处理组的麦角甾醇含量显著低于对照组(P<0.05),第7天时,相比对照组,减少了35%(P<0.05)。结果表明,抗菌肽P-1可以有效抑制T.roseum麦角甾醇的合成,引起细胞膜结构和功能受损,从而达到抑菌作用。

a-T.roseum菌体生物量；b-麦角甾醇含量图4 抗菌肽P-1处理对T.roseum菌体生物量和麦角甾醇含量的影响Fig.4 Effects of antifungal peptide P-1 treatment on T.roseum biomass and ergosterol content注：竖线代表标准偏差(±SD),*代表组内差异显著(P<0.05)(下同)

2.6 抗菌肽P-1对T.roseum细胞膜通透性的影响

2.6.1 荧光染料N-苯基-1-萘胺摄取率的测定结果

N-苯基-1-萘胺(N-phenyl-1-naphthylamine,NPN)是一种疏水荧光探针,在水环境中不会发出荧光,但在疏水环境中会发出强烈的荧光[26]。因此可以利用荧光染料NPN来评价抗菌肽P-1通过T.roseum细胞外膜的能力。图5反映了T.roseum胞内荧光NPN摄取率随培养时间的变化情况。结果显示,在整个培养过程中,随着时间的延长,NPN摄取率呈现增强趋势,且在每个时段,处理组的NPN摄取率显著高于对照组(P<0.05)。在第7天时,其高出对照组24%(P<0.05),说明抗菌肽P-1处理可造成T.roseum细胞外膜通透性增大,使NPN与膜上的磷脂分子中的疏水基结合,产生荧光。

图5 抗菌肽P-1处理对T.roseum菌体NPN荧光吸收强度的影响Fig.5 Effect of antifungal peptide P-1 treatment on NPN fluorescence absorption intensity of T.roseum cells

2.6.2 电导率测定结果

电导率的变化可反映细胞膜渗透性的改变[27]。图6显示,随着培养时间的增加,处理组菌体细胞相对电导率明显高于对照组,在第7天,比对照组高35%(P<0.05),表明抗菌肽P-1处理使T.roseum细胞膜的渗透性发生改变,导致细胞内外渗透压的调节能力下降,使细胞失水或胀破,从而起到抑菌作用。

图6 抗菌肽P-1处理对T.roseum菌体相对电导率的影响Fig.6 Effect of antifungal peptide P-1 treatment on relative conductivity of T.roseum cells

2.7 抗菌肽P-1对T.roseum菌体活性氧代谢的影响

图7 P-1处理对T.roseum菌体的影响Fig.7 Effect of P-1 treatment on superoxide anion of T.roseum

2.7.2 对抗氧化酶系(SOD、CAT、POD)和H2O2含量的影响

图8反映了P-1处理对参与ROS反应的相关抗氧化酶系活力和H2O2含量的影响。随着培养时间的延长,SOD活性呈现下降趋势,第1、3天,处理组的SOD活性都显著低于对照组(P<0.05)(图8-a)；CAT活性呈先增大后减小的趋势,处理组的CAT活性显著高于对照(P<0.05)(图8-b)；POD整体呈现增大的趋势,且处理组的POD活性显著高于对照组(P<0.05)(图8-c)；H2O2含量呈现下降的趋势,且处理组的H2O2的含量显著低于对照组(P<0.05)(图8-d)。结果表明抗菌肽P-1处理加剧了T.roseum胞内的抗氧化程度。

a-SOD活力；b-CAT活力；c-POD活力；d-H2O2含量图8 抗菌肽P-1处理对T.roseum 菌体SOD活力、CAT活力、POD活力及H2O2含量的影响Fig.8 Effect of antifungal peptide P-1 on SOD,CAT,POD activity and the content of H2O2 in T.roseum

2.7.3 对脂质过氧化、蛋白羰基化的影响

脂质和蛋白是细胞膜的主要组成部分,由ROS大量积累引起的脂质和蛋白的氧化损伤,可直接影响T.roseum的正常生理活动。由图9可知,随着培养时间的延长,处理组的脂质过氧化值(OD535)高于对照组,第7天时,OD535高于对照组55%(P<0.05)(图9-a)；处理组蛋白羰基含量显著高于对照组。第7天时,羰基含量高于对照组71.96%(P<0.05)(图9-b)。上述结果表明抗菌肽P-1处理使T.roseum细胞膜氧化损伤引起的脂质过氧化和蛋白羰基化程度加深。

a-T.roseum菌体OD535；b-羰基含量图9 抗菌肽P-1处理对T.roseum菌体OD535和羰基含量的影响Fig.9 Effect of P-1 treatment on OD535 and carbonyl content of T.roseum

2.7.4 对MDA含量的影响

MDA是膜脂过氧化作用的主要产物之一,一般利用其含量作为膜脂过氧化的指标,反映细胞膜脂质过氧化的程度[28]。由图10可知,处理组MDA含量显著高于对照组,第7天时,MDA含量比对照组高67.6%(P<0.05)。表明抗菌肽P-1处理使菌体发生膜脂质过氧化反应,引起菌体MDA含量升高,最终导致细胞膜受损。

图10 抗菌肽P-1处理对T.roseum菌体MDA含量的影响Fig.10 Effect of antifungal peptide P-1 treatment on MDA content of T.roseum

3 讨论与结论

本试验从超微结构、细胞膜通透性及ROS代谢3个方面研究了抗菌肽P-1处理对T.roseum有抑菌作用。液体培养结果显示,抗菌肽P-1处理能够明显抑制T.roseum菌体生物量的增加,通过超微观察发现P-1破坏了T.roseum孢子的细胞壁膜、局部出现了缺口、细胞质大量流出,致使孢子的形态发生了剧烈的变化,胞质变得不均匀。这可能是抗菌肽P-1抑制T.roseum菌体生长的主要原因[29]。

细胞膜是主要由磷脂构成的富有弹性的半透性膜,麦角甾醇可以与磷脂结合形成稳定磷脂相,进而增加细胞膜的稳定性[30]。本研究结果显示,抗菌肽P-1处理使T.roseum细胞膜上麦角甾醇含量减少,可能是由于抗菌肽P-1抑制了麦角甾醇的生物合成途径,使膜的结构和完整性受到影响,使NPN这种对细胞外膜敏感性荧光染料透过了细胞外膜,与膜上的磷脂双分子层中的疏水基产生了结合；同时,抗菌肽P-1处理后T.roseum菌体细胞相对电导率的不断增大,进一步证明抗菌肽P-1处理破坏了细胞膜的结构,改变了膜的稳定性。

本研究从超微结构、膜通透性以及ROS代谢的研究中推测出抗菌肽P-1对粉红单端孢的抑菌机理可能是通过破坏T.roseum菌体膜的完整性,改变膜的通透性,以及诱导ROS在胞内的积累,引起氧化胁迫反应,从而导致细胞膜完整性丧失,菌体生长受到抑制。