柞蚕蛹脂肪体细胞的原代培养及观察

孙誉轩，陈晨，李俊

（淮北师范大学 生命科学学院，安徽 淮北 235000）

0 引言

昆虫细胞培养作为细胞工程的重要组成部分，已广泛运用在分子生物学、免疫学、生物反应器研发等领域［1］.自Grace［2］设计出Grace昆虫细胞培养基，建立桉蚕（Antheraea eucalypti）卵巢细胞系以来，昆虫组织及细胞培养取得快速发展.有统计的数据表明，昆虫中已经建成的细胞系已达800余株［3］.但相较于昆虫的巨大数量来讲，目前已经建成的细胞系还远远不能满足对特定物种和特定功能细胞的研究.已建成的细胞系中，母细胞来源通常采用胚胎或卵巢，其优点是再生潜力较高，如黄粉虫、甜菜夜蛾等［4-5］.其他来源亦有中肠、脂肪体、器官芽和血液等［6］.此外，在达摩凤蝶细胞系的建立过程中采用新孵的幼虫为母细胞来源［7］.在甜菜夜蛾中，Wu等［8］采用蛹组织为材料，获得对甜菜夜蛾核多角体病毒（SeMNPV）和苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒（AcMNPV）高敏感的NTU-SE细胞系.基于不同组织或细胞类型建立的细胞系丰富昆虫的细胞系类型，对病毒敏感型细胞株筛选及特定组织的功能研究具有重要意义.

脂肪体组织是昆虫能量储存和代谢的主要场所.组成脂肪体组织的细胞主要是滋养细胞（trophocyte）、尿细胞（urocyte）和含菌细胞（mycetocyte）.滋养细胞是脂肪体组织的主要细胞，在不同的昆虫类型和生命阶段其细胞的形状多样且不规则，脂肪以小的脂滴或以大的液泡形式占据滋养细胞细胞质的大部分空间［9］.脂肪体除为昆虫生长发育提供能量外，还具有多种生理功能.脂肪体是昆虫先天免疫过程中体液免疫的重要组织，通过合成抗菌肽抵御病原菌入侵.此外，脂肪体受蜕皮激素（20E）调控参与蛹期脂肪体解离及变态发育过程［10］.目前利用昆虫脂肪体组织建成的脂肪体细胞系还较少.但对于脂肪体生理功能及脂类代谢等研究来讲，脂肪体的原代培养及细胞系建立是十分必要的.

柞蚕是大蚕蛾科的绢丝昆虫，其体型较大，易于解剖，进行组织或细胞培养.关于柞蚕脂肪体的原代培养还未有相关研究报道.本研究以柞蚕脂肪体组织为材料进行原代培养，观察原代培养过程中脂肪体细胞的各种形态.通过转染昆虫表达载体，验证脂肪体细胞的转染能力和外源蛋白表达能力.

1 材料与方法

1.1 材料、主要试剂及仪器

柞蚕蛹为青6号品种，购自吉林省蚕业研究所.Grace培养基及胎牛血清均购自美国GIBCO公司.青霉素、链霉素双抗购自武汉普诺赛.高效转染试剂StarFectⅡ购自北京康润诚业.实验主要仪器为美国Thermo公司8000WJ型培养箱；上海三发SF-CJ-1型超净台；日本奥林巴斯IX71型荧光倒置显微镜.

1.2 柞蚕蛹脂肪体组织的获取

在超净台中，将柞蚕蛹置于含75%酒精的离心管中浸洗消毒30 min，随后用无菌水冲洗蛹体表2～3次，再用灭菌纱布擦干体表水分.用无菌的剪刀将柞蚕表皮剪开一小口，用镊子夹取脂肪体组织，置于盛有灭菌生理盐水的无菌平皿中.去除与脂肪体连接的马氏管、卵巢或精巢等组织后，将脂肪体在含有生理盐水的平皿中漂洗3次，去除血细胞和脂肪滴.最后转移至新的盛有生理盐水的平皿中，再转移至无菌的培养皿或培养瓶中.

1.3 柞蚕蛹脂肪体的原代培养及染色

用镊子和剪刀将脂肪体组织分成较小的组织块，接种于细胞培养瓶T25中，组织块先不加培养基，并用吸管吸去表面液体，倒置并使其牢固贴壁.经2 h倒置贴壁后在组织块周边滴加Grace培养基（含20%血清及终浓度100 U/mL青霉素、链霉素双抗），置于27℃培养箱中培养.经过24 h培养后，缓缓的加入3 mL培养基.随后置于27℃培养箱中长期培养.

将脂肪体组织接种至60 mm的培养皿中培养一段时间后进行油红O染色.染色前小心吸弃培养基和脂肪体组织块，并用磷酸盐缓冲液（PBS）洗3次，向培养皿中加入4%的甲醛固定细胞30 min.随后用PBS稀释油红O染液储备液至终浓度3 mg/mL，加入培养皿.室温染色30 min，随后吸弃染液，并加入PBS洗数次直到透明，置于显微镜下观察.

1.4 柞蚕脂肪体细胞的转染

将脂肪体细胞培养于60 mm的培养皿中，按转染试剂盒的操作说明将7.5μL转染试剂和2.5μg昆虫表达载体pIZT/V5-His（带有绿色荧光蛋白GFP基因）震荡混匀成复合物，室温孵育10 min后加入培养皿中，轻摇使其充分混匀.27℃培养24～48 h，置于荧光倒置显微镜观察.

2 结果与分析

2.1 蛹脂肪体原代培养的组织细胞类型和特点

本研究以倒置贴壁法对柞蚕蛹脂肪体进行原代培养，相较于直接贴壁培养，倒置贴壁更有助于脂肪体的贴壁和脂肪体细胞的解离.柞蚕脂肪体组织块贴壁后约3 d即能观察到脂肪体细胞的解离，解离的脂肪体细胞部分悬浮于培养基中，部分贴壁于培养瓶底部（图1A）.经过5 d左右的培养后，可观察到少量脂肪组织块周围出现辐射状细胞，初期较为细长.部分脂肪组织块周边可看到含有油滴的细纹状细胞（图1B）.随着时间的增长，这些细长的细胞逐渐的部分聚集，包含的油滴越来越多.

经过约5 d的培养，在组织块周围出现一些长的梭形细胞，并不断向外伸展.梭形细胞的细胞体积较大，细胞呈梭形或不规则圆形、多角形，细胞核位于细胞中央清晰可见.经过约15 d培养，梭形细胞不断向外扩展，呈放射状生长（图1C）.此时细胞数量不断增加，细胞生长较快，细胞相互之间相互挤压连接.经过约30 d的培养，梭形细胞生长变缓，在梭形细胞的相互连接处开始逐渐出现一些小的圆形脂肪体细胞，其形态规则，细胞核清晰可见，可能是由梭形细胞分化产生（图1D）.

经过约10 d左右的培养，部分脂肪体除解离出较大的颜色较深的脂肪体细胞外，在一些组织周围开始出现小的卵圆形细胞（图1E），其大小与梭形细胞分化产生的圆形细胞相比略小.在前期培养阶段卵圆形细胞的分裂能力较强，随后细胞不断长大，颜色加深，并逐渐成熟.培养约30 d左右，许多卵圆形细胞开始聚集成团块状，但仍有许多卵圆形细胞不断增殖（图1F）.在脂肪体组织周围解离出的细胞中，卵圆形细胞的数量最多，生长最快，成熟颜色加深以后与组织解离出的成熟圆形脂肪体较为相近.

除上述几种生长较快的细胞外，在脂肪体的原代培养过程中，还观察到一些其他类型的细胞.瘤状细胞在经过约5 d左右的培养时产生（图1G）.瘤状细胞是成熟脂肪体解离后多个细胞聚集形成的一种类似瘤体的细胞.瘤状细胞的分裂增殖能力较弱，经过约30 d的培养后，许多贴壁生长的瘤状细胞不再贴壁，或出现大量的脂肪油滴，逐渐死亡.在培养的过程中，还观察到少量管道状细胞，其细胞较其他类型的细胞明显细长，细胞颜色较浅，较为透明，脂肪滴在整个细胞中可较为明显观察到（图1H）.

图1 原代培养中不同形态的柞蚕脂肪体细胞的观察

2.2 原代培养细胞的转染和观察

取培养较好的15 d左右的原代脂肪体细胞，加入转染试剂和pIZT/V5-His表达载体，使载体转染进入脂肪体细胞中.由于载体上带有GFP基因，若转染进入细胞中，则GFP蛋白表达后可通过荧光显微镜观察到绿色荧光.观察发现，转染24 h后，卵圆形脂肪体细胞已能观察到绿色荧光（图2A）.结果表明新生的细胞具有较强的活性，具有一定的转染能力.经过48 h的转染后，大多数卵圆形的脂肪体细胞均可见绿色荧光（图2B），表明转染效率较高.

图2 pIZT/V5-His昆虫表达载体转染原代培养的脂肪体细胞

2.3 原代培养脂肪体细胞的油红O染色观察

油红O为脂溶性染料，用于脂肪或脂类物质含量高的细胞或组织的染色.基于此，通过油红O染色对不同形态的脂肪体细胞进行染色观察和鉴定.结果表明，在脂肪体细胞的原代培养过程中，梭形细胞和卵圆形细胞的染色均较为清晰，细胞核均清晰可见（图3A、3B），表明这些细胞中脂肪含量均较高，符合脂肪体细胞的特点.此外，油红O的染色液表明瘤状细胞和管道状细胞也含有较多的脂肪（图3C、3D）.这些脂肪后期会随着细胞的死亡以油滴的形式分散于整个培养基或贴壁于培养皿底部，影响其他正常细胞的贴壁生长，给原代培养和细胞系构建带来一定的困难.

图3 不同形态柞蚕脂肪体细胞的油红O染色观察

3 讨论

昆虫的脂肪体类似于人体的肝脏和脂肪，是昆虫脂类和糖类代谢以及多种中间代谢过程的主要器官［11-12］.不同种类昆虫的脂肪体组织形态存在一些差异，有些为片层状，有些为串珠状或条带状等［9］.脂肪体组织通常由中胚层起源的细胞组成，有时也包含一些外胚层细胞，因此在脂肪体原代培养过程中会出现多种形态的细胞，并可反映其胚层起源.在柞蚕脂肪体的原代培养过程中观察到多种形态的细胞，这些细胞的形态和特点与文献［13］研究结果较为一致.柞蚕脂肪体原代培养中，卵圆形细胞的分裂增殖能力较强，从点状分布逐渐发展成成片分布，最后聚集成团块状.在家蚕脂肪体原代培养中，Kishimoto等［14］发现卵形细胞和球形细胞聚集成网格状组织的现象，这些网格状组织中的细胞分裂繁殖能力较强.除卵圆形细胞外，长期的培养观察表明，梭形细胞等也具有较强的分裂增殖能力.然而，这些细胞增殖能力随着培养时间的增加而减缓.油红O染色也表明许多脂肪体细胞在长期培养后逐渐出现细胞死亡，脂质油滴分散至培养基中.因此，通过脂肪体的原代培养，筛选出增殖能力强的细胞类群，如卵圆形细胞，建立柞蚕脂肪体组织的细胞系具有一定的可行性.

本研究采用的倒置贴壁法更容易使贴壁的组织块游离出脂肪体细胞，原代培养效果较好.目前已有的柞蚕原代培养多采用精巢、卵巢等分裂能力较强的组织，培养方法采用组织块直接贴壁法、胰酶消化法等，培养基采用TC-100、Grace等.柞蚕蛹卵巢原代培养中，王林美等［15］对培养方法和培养基进行对比，表明采用机械分散法及MGM-448培养基的细胞贴壁效果好，生长旺盛.对于分裂能力相对较弱的脂肪体组织来讲，倒置贴壁有助于脂肪体组织更好贴壁并适应新的体外培养环境，较快解离或游离出脂肪体细胞，加快原代培养进程.因此，培养方法、培养基等条件可影响细胞的分裂和分化潜能，进而影响柞蚕相关组织细胞系的建立.本研究为柞蚕原代培养提供良好的方法补充，可为柞蚕脂肪体功能研究打下良好的基础.

目前，柞蚕中还未有脂肪体细胞系建立的报道，仅有柞蚕胚胎细胞系的建立和成虫卵巢细胞株的建立［16］.细胞株系的建立对相关组织的功能研究提供很好的材料，但一般周期较长.本研究成功在原代培养的脂肪体细胞中直接进行转染表达外源基因，表明脂肪体细胞较好的转染能力，特别是一些活性较强的新生细胞.因此，在原代培养过程中去除较大的组织块，通过细胞转染可实现基因在脂肪体细胞中表达，这对于柞蚕脂肪体功能的研究具有重要的意义.