霉菌毒素吸附剂与有机酸或植物精油的复合物对蛋鸡饲粮养分表观消化率及肠道微生物的影响

陈继发

（宜春学院生命科学与资源环境学院，江西省高等学校硒农业工程技术研究中心，江西宜春 336000）

肠道是家禽消化和吸收饲粮养分的主要场所，健康的肠道有利于提高养分利用率。肠道微生物能够与宿主争夺肠腔中的养分，过度繁殖的致病菌会消耗肠腔内养分，降低饲料利用率[1]。调节肠道菌群平衡、改善肠道健康是提高饲料利用率、实现家禽高效生产的重要课题。蒙脱石等霉菌毒素吸附剂（Mycotoxin Adsorbent，MA）能优化家禽肠道菌群、提升肠道健康水平[2-3]。有机酸（Organic Acid，OA）和植物精油（Essential Oil，EO）具有抗菌、抑炎功能[4-5]，可提升家禽肠道健康水平、促进饲粮养分消化吸收[6-7]。饲粮被多种低浓度[含量未超过我国《饲料卫生标准》（GB 13078—2017）]霉菌毒素污染和致病菌引发的肠道疾病是当前蛋鸡生产中较普遍面临的问题。前期研究发现，饲粮添加MA-OA 复合物和MA-EO 复合物对蛋鸡产蛋率、日产蛋重、平均日采食量和料蛋比均无显著影响[8]。根据MA、OA 和EO 的功能，推测饲粮添加MA-OA 复合物和MA-EO 复合物也许能有效调节蛋鸡肠道菌群结构、改善肠道健康，促进饲粮养分消化吸收，提高养分利用率。因此，本试验旨在研究含有多种低剂量霉菌毒素饲粮（黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、伏马菌素、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、赭曲霉毒素A 和T-2 毒素含量未超标）[8]中添加MA-OA 复合物和MA-EO 复合物对蛋鸡血浆生化指标、养分表观消化率、肠黏膜养分转运载体基因表达及肠道微生物的影响，为其在蛋鸡生产中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料 MA-OA 复合物主要成分：MA（蒙脱石）80%，OA（主要为甲酸、丙酸和丁酸）＞10%；MA-EO复合物主要成分：MA（蒙脱石）75%，EO（主要为丁香酚和肉桂醛）含量＞ 4%。MA-OA 复合物、MA-EO复合物主要是利用蒙脱石特殊的晶层结构和理化性质，通过蒙脱石表面改性、电荷调控，与丁香酚、肉桂醛或甲酸、丙酸等组装、表面交联等工艺制备而成。

1.2 试验设计与饲养管理 选用29 周龄健康的罗曼粉壳蛋鸡270 只，随机分为3 组，每组6 个重复，每个重复15 只。对照组饲喂基础饲粮，试验组分别饲喂在基础饲粮中添加0.65 g/kg MA-OA 复合物（MA-OA 复合物组）、0.70 g/kg MA-EO 复合物（MA-EO 复合物组）的试验饲粮。预试期1 周，正试期10 周。基础饲粮参考《鸡饲养标准》（NY/T33-2004）设计，其组成及营养成分见表1。

表1 基础饲粮组成及营养成分（风干基础）

试验鸡只采用3 层阶梯式笼养，每笼饲养3 只。试验期鸡舍内平均温度、相对湿度分别为（25.6±2.8）℃、（77.2±6.3）%。每日于08:00、15:00 喂料，自由饮水，人工光照与自然光照相结合，光照时间为16 h/d。

1.3 样品采集 在试验第67 天，每个重复随机选取1 只蛋鸡单笼饲养，采用内源性指示剂法开展为期3 d 的代谢试验，于鸡笼底部放置干净的集粪盘，参照文献[9]的方法收集粪样、制备风干粪样和饲料样，置于干燥器中保存。

试验第70 天清晨，每个重复随机选择2 只蛋鸡（空腹）进行采血。参照文献[8]的方法采集血液样品和制备血浆，并置于-20℃保存。此外，从每个重复随机选取1 只未禁食的蛋鸡，参照文献[9-10]的方法采集十二指肠内容物和空肠黏膜样品（每份采集1～2 g），-80℃下冻存。

1.4 测定指标与方法

1.4.1 血浆生化指标 血浆样品于4℃解冻后，使用全自动生化分析仪（BS-200，深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司）测定血浆生化指标，测定方法参照迈瑞公司生产的试剂盒相应说明书进行。

1.4.2 养分表观消化率 参照文献[11]的方法检测粪便与饲粮干物质、能量、粗脂肪、粗蛋白质、粗灰分、钙和磷的含量。粪便与饲粮中盐酸不溶灰分含量按照《饲料中盐酸不溶灰分的测定》（GB/T 23742—2009）的方法测定。计算公式：

某养分表观消化率=100%－100%×（饲粮中盐酸不溶灰分含量×粪便中某养分含量）/（饲粮中某养分含量×粪便中盐酸不溶灰分含量）

1.4.3 空肠黏膜养分转运载体基因表达 使用Trizol试剂（TaKaRa，日本）提取蛋鸡空肠总RNA，经检测合格的RNA 样品用反转录试剂盒（TaKaRa，日本）制备cDNA，然后以其为模板使用RT-PCR 试剂盒（TaKaRa，日本）进行PCR 扩增，反应体系和反应程序参照文献[9]。引物由上海生工生物有限公司合成，B0系统中性氨基酸转运载体（B0AT）引物为F：TATCCTGGCTGGGTCTATGC；R：AGGCCTGTACGA TCCCTTCT。

小肽转运载体1（PepT1）、钠依赖性葡萄糖转运载1（SGLT1）、易化葡萄糖转运载体2（GLUT2）和β-肌动蛋白引物序列参照文献[9]，采用2-ΔΔCt法计算目的基因mRNA 表达量。

1.4.4 肠道微生物相对含量 每份肠道内容物样品称取约0.2 g 置于2 mL EP 管中，用粪便基因组DNA 提取试剂盒（DP328，天根生化科技（北京）有限公司）提取细菌DNA，将所有合格DNA 样品的浓度稀释至100 ng/μL。使用RT-PCR 试剂盒（TaKaRa，日本）进行PCR 扩增，反应体系、反应程序和引物序列参照文献[10]。以总菌为参比基因，采用2-ΔΔCt法计算目的细菌的相对含量[10]。

1.5 统计分析 利用SAS 9.2 软件对试验数据作单因素方差分析，差异显著者用Duncan's 法进行多重比较。结果用平均值±标准差表示，P＜0.05 为差异显著。

2 结果

2.1 MA-OA 复合物和MA-EO 复合物对蛋鸡血浆生化指标的影响 试验结果显示，MA-OA 复合物和MA-EO复合物对所测定的血浆生化指标均无显著影响（表2）。

表2 MA-OA 复合物和MA-EO 复合物对蛋鸡血浆生化指标的影响

2.2 MA-OA 复合物和MA-EO 复合物对蛋鸡饲粮养分表观消化率的影响 试验结果显示，各组间干物质、粗蛋白质、粗脂肪、粗灰分、钙和磷表观消化率均无显著差异（表3）。与对照组、MA-EO 复合物组相比，MA-OA 复合物组能量表观消化率分别提高了18.67%、12.47%（P＜0.05）。

表3 MA-OA 复合物和MA-EO 复合物对蛋鸡饲粮养分表观消化率的影响 %

2.3 MA-OA 复合物和MA-EO 复合物对蛋鸡空肠黏膜养分转运载体基因表达的影响 由表4 可知，各组间蛋鸡空肠黏膜B0AT、PepT1、GLUT2mRNA 表达水平均无显著差异。与对照组、MA-EO 复合物组相比，MA-OA复合物组空肠SGLT1mRNA 表达量提高（P＜0.05）。

表4 MA-OA 复合物和MA-EO 复合物对蛋鸡空肠黏膜养分转运载体基因表达的影响

2.4 MA-OA 复合物和MA-EO 复合物对蛋鸡十二指肠微生物相对含量的影响 由表5 可知，MA-OA 复合物和MA-EO 复合物对蛋鸡十二指肠内容物双歧杆菌、产气荚膜梭菌、沙门氏菌和肠球菌相对含量均无显著影响。与对照组相比，MA-OA 复合物组、MA-EO 复合物组十二指肠大肠杆菌相对含量降低（P＜0.05）。MA-OA复合物组十二指肠乳酸杆菌相对含量高于对照组和MA-EO 复合物组（P＜0.05）。

表5 MA-OA 复合物和MA-EO 复合物对蛋鸡十二指肠微生物相对含量的影响

3 讨 论

3.1 MA-OA 复合物和MA-EO 复合物对蛋鸡血浆生化指标的影响 谷丙转氨酶和谷草转氨酶是反映动物肝脏健康水平的重要指标。研究表明，饲粮添加EO、OA能够提升动物肝脏健康水平[12-13]，这与其能够抑制肠道病原体、维护肠屏障功能有关，可降低致病菌和毒素“移位”，进而减少肝脏损伤[6-7]。作者前期研究发现，在霉菌毒素含量超标饲粮中添加MA 能够改善蛋鸡肝脏健康[14]。本试验结果表明，添加MA-OA 复合物、MA-EO 复合物对蛋鸡血浆谷草转氨酶和谷丙转氨酶活性均无显著影响，与上述研究的试验结果不一致，可能与添加剂的使用量和饲粮霉菌毒素含量存在差异有关。另外，本试验中，添加MA-OA 复合物、MA-EO 复合物对蛋鸡血浆中反映机体养分代谢的指标均无显著影响，提示二者可能不影响蛋鸡机体蛋白质、脂质和糖类代谢。而有研究指出，饲粮添加MA、OA 或EO 能够改善蛋鸡血液中部分养分代谢指标[15-17]，可能因蛋鸡生产阶段、饲粮组成、添加剂成分和使用剂量、试验周期等不同造成试验结果存在差异。

3.2 MA-OA 复合物和MA-EO 复合物对蛋鸡饲粮养分表观消化率的影响 本试验发现，添加MA-OA 复合物显著提高了饲粮能量表观消化率，一定程度上提高了干物质、粗蛋白质和粗脂肪的表观消化率。研究认为，添加一定水平的蒙脱石不会影响肉鸡对饲粮养分的消化率[18]；添加0.5 g/kg 蒙脱石对蛋鸡饲粮养分表观消化率无显著影响[9]。刘艳利等[19]报道，蛋鸡饲粮添加OA（主要为丁酸甘油酯）一定程度上提高了饲粮能量和粗蛋白质的真消化率，显著提高了钙和磷的表观消化率；另外，添加复合OA 显著提高了肉鸡饲粮粗蛋白质和粗脂肪的表观消化率[17]。综上，MA-OA 复合物改善蛋鸡饲粮养分表观消化率的作用与含有OA 有关，其能够降低肠道pH、抑制肠道有害菌、改善肠黏膜形态以及提高肠道消化酶活性[6,17,19]，进而有利于促进动物对饲粮养分的消化、吸收。

3.3 MA-OA 复合物和MA-EO 复合物对蛋鸡空肠黏膜养分转运载体基因表达的影响 小肠黏膜养分转运载体的正常表达对于饲粮养分吸收非常重要。本试验发现，饲粮添加MA-OA 复合物显著上调了蛋鸡空肠黏膜SGLT1mRNA 表达水平，一定程度上提高了GLUT2和PepTlmRNA 表达量，提示MA-OA 复合物可能增强了肠道对葡萄糖和小肽的吸收能力，有利于提高饲粮养分利用率。研究表明，饲粮添加蒙脱石显著上调了蛋鸡空肠黏膜碱性氨基酸转运载体1 mRNA 表达水平[9]；梁赛赛[20]报道，添加OA 在一定程度上提高了蛋鸡小肠黏膜SGLT1、GLUT2、B0AT和y+L 氨基酸转运载体2 mRNA 表达量。以上研究表明，添加蒙脱石和OA 有利于促进蛋鸡肠黏膜养分转运载体的表达。本试验结果也表明，MA-OA 复合物组能量和粗蛋白质的表观消化率较对照组均有提高，且血浆总蛋白、白蛋白和葡萄糖含量也有一定增加。可见，养分转运载体mRNA 的表达水平与相应养分表观消化率和血浆相关指标的结果基本可以相互佐证。肠道刷状缘膜和基底膜中养分转运载体的表达受肠腔内养分调节，某养分含量提高，相应转运载体的活性将随之提高[21]，提示MA-OA 复合物也许是通过促进蛋鸡对饲粮养分的消化使肠腔内小分子养分的含量增加，进而提高相关转运载体的表达。

3.4 MA-OA 复合物和MA-EO 复合物对蛋鸡十二指肠微生物相对含量的影响 研究表明，饲粮添加蒙脱石、OA或EO 能够降低家禽肠道有害菌数量，调节肠道微生态平衡[6,10,19]。据报道，蒙脱石对有害菌有吸附作用，能固定细菌随动物肠道蠕动而排出体外[22]。OA 可降低动物肠道pH，利于有益菌生长繁殖，抑制有害菌增殖[7,17,19]。EO能够直接杀灭有害菌[4]。综上表明，蒙脱石和OA、蒙脱石和EO 联用能够有效控制肠道有害菌，优化肠道菌群。Lillehoj 等[23]研究表明，MA-OA 复合物对产气荚膜梭菌和艾美球虫诱导的肉鸡坏死型肠炎具有明显缓解作用。本试验发现，饲粮添加MA-OA 复合物和MA-EO 复合物均不同程度降低了蛋鸡十二指肠产气荚膜梭菌、大肠杆菌和沙门氏菌相对含量。此外，添加MA-OA 复合物还提高了有益菌（如乳酸杆菌）相对含量，这与OA 具有降低肠道pH 的作用有关；同时肠道有害菌减少，间接对有益菌的生长繁殖带来益处。肠道微生物会与宿主争夺肠腔内养分，当肠道有害菌减少，有害菌同机体争夺养分的竞争力降低[1]，进而有利于提高饲粮养分利用率。本试验中，蛋鸡肠道有害菌含量降低和乳酸杆菌含量提高可能是MA-OA 复合物提高饲粮能量表观消化率的主要原因之一。

4 结 论

本研究结果表明，饲粮添加0.65 g/kg MA-OA 复合物、0.70 g/kg MA-EO 复合物可以调节蛋鸡肠道菌群结构；添加MA-OA 复合物能够提高蛋鸡饲粮能量表观消化率。