乌梅有机酸基于TGF-β/Smad信号通路对高糖诱导心肌纤维化的保护作用

代 天,刘 敏,杨 萍,姚 峰,余信强,赵 璠,张苏川

(江汉大学附属医院,武汉市第六医院心血管内科,武汉 430015;*通讯作者,E-mail:zhangsuchuan1@163.com)

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy,DCM)是糖尿病患者常发生的一种并发症,心肌纤维化是其致病基础,能导致心脏顺应性及收缩功能下降,引发心衰、泵衰竭、房颤等多种心脏病理症状[1,2]。糖基化终末产物在高糖环境中大量合成,诱导炎性因子过表达,引发炎症,刺激心脏成纤维细胞增殖,促进胶原蛋白合成分泌,是导致心肌纤维化的主要原因,减轻炎症是缓解心肌纤维化过程的有效方法[3,4]。乌梅是药食同源药材,来自于蔷薇科植物梅的成熟果实,具有生津止渴、敛肺涩肠、安蛔止泻、清咽止咳的功效,乌梅丸能显著抑制免疫性结肠炎大鼠炎性因子表达,降低结直肠组织损伤,还可降低2型糖尿病大鼠血糖,调节肠道菌群,减轻炎症反应,改善其临床症状[5,6]。乌梅有机酸是乌梅的主要活性成分,具有抑制消炎的作用[7],但其是否可防治心肌纤维化,目前还未有明确研究。TGF-β/Smad是调控成纤维细胞增殖,组织纤维化发生发展的主要信号,在DCM病理过程中,TGF-β1表达上调,Smad3磷酸化增强,成纤维细胞活化增殖,引发心肌纤维化;阻断TGF-β/Smad信号传导,可抑制成纤维细胞增殖,减少胶原蛋白合成沉积,减轻心肌纤维化,改善心功能[8,9]。另有研究发现,以升陷乌梅汤干预哮喘大鼠,可抑制TGF-β1/Smad信号激活,延缓肺功能损伤[10]。但乌梅有机酸能否通过调控TGF-β/Smad信号缓解高糖诱导的心肌纤维化,目前还没有报道,本文以乌梅有机酸处理高糖诱导的新生大鼠心肌成纤维细胞,对此进行探索研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂 新生大鼠原代心肌成纤维细胞(货号PR486),购自广州柏赛柯生物技术有限公司;乌梅药材(货号XY26138),购自上海信裕生物科技有限公司;TGF-β1重组蛋白(货号A04398),购自上海禾午生物科技有限公司;D-葡萄糖粉(货号G8150)、DMEM低糖培养基(货号31600)、青链霉素混合液(货号P1400)、胎牛血清(货号11011-8611)、胰蛋白酶-EDTA消化液(货号T1300)、CCK-8试剂盒(货号CA1210)、大鼠TNF-α ELISA试剂盒(货号SEKR-0009)、大鼠IL-6 ELISA试剂盒(货号SEKR-0005)、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒(货号P1200-50T)、高效RIPA裂解液(货号R0010)、BCA蛋白浓度测定试剂盒(货号PC0020),均购自美国Solarbio公司;大鼠Ⅲ型前胶原氨基端肽(procollagen Ⅲ N-terminal peptide,PⅢNP)ELISA试剂盒(货号JL20753),购自上海将来实业股份有限公司;大鼠Ⅰ型前胶原蛋白羧基末端肽(procollagen type Ⅰ carboxy-terminal peptide,PICP)ELISA试剂盒(货号ER0322),购自武汉菲恩生物科技有限公司;兔源GAPDH一抗(货号ab181602)、兔源TGF-β1一抗(货号ab179695)、兔源Smad3一抗(货号ab40854)、兔源p-Smad3一抗(货号ab52903)、羊抗兔二抗(货号ab150077),均购自美国Abcam公司等。

1.1.2 主要仪器 酶标仪(型号varioskan LUX)、凝胶成像系统(型号IBright CL 1500)购自美国Thermo Fisher Scientific公司;电泳仪(型号EPS 300)、转膜仪(型号Tanon)购自美国Bio-Rad公司等。

1.2 方法

1.2.1 细胞模型制备及乌梅有机酸浓度筛选 培养液配制:DMEM低糖(5.5 mmol/L葡萄糖)培养基中加入10%胎牛血清、100 U/ml青链霉素溶液,混匀,即获得细胞完全培养液;细胞完全培养液中加入D-葡萄糖粉,至葡萄糖终浓度为33.3 mmol/L[11],混匀,即获得细胞高糖培养液。

通过CCK-8实验测得不同浓度乌梅有机酸对原代心肌成纤维细胞增殖的影响,计算出IC50值,进而筛选出最佳作用浓度:购买的新生大鼠原代心肌成纤维细胞快速解冻,复苏后接种于25 cm2培养瓶,平放在95%湿度、37 ℃、5%CO2的恒温培养箱中培养。取处于对数生长期的传代细胞,以0.5×105个/ml的密度接种在96孔板,培养24 h后,更换高糖培养液进行高糖诱导,同时以终浓度0,0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0 mg/ml的乌梅有机酸[7]处理,继续培养48 h后,更换为完全培养液,同时加入CCK-8试剂,1.5 h后于450 nm波长下测出各孔吸光度(optical density,OD),计算细胞活力,获得IC50值,细胞活力=(实验组OD值-空白组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)×100%。根据实验结果选择2 mg/ml的乌梅有机酸进行后续实验。

1.2.2 细胞分组及处理 取处于对数生长期的传代细胞,接种在24孔板,随机分为对照组、高糖组、乌梅有机酸(2 mg/ml)组、TGF-β1(5 ng/ml)组、乌梅有机酸(2 mg/ml)+TGF-β1(5 ng/ml)组。高糖组和用药组细胞按照1.2.1中方法进行高糖诱导,同时乌梅有机酸组细胞以终浓度2 mg/ml的乌梅有机酸处理,TGF-β1组细胞以终浓度5 ng/ml的TGF-β1[12]处理,乌梅有机酸+TGF-β1组细胞以终浓度2 mg/ml的乌梅有机酸和终浓度5 ng/ml的TGF-β1联合处理,48 h后收集细胞及细胞培养上清液。

1.2.3 CCK-8实验检测各组细胞活力 取处于对数生长期的传代细胞,以0.5×105个/ml的密度接种在96孔板,按照1.2.2中方法分组处理,通过CCK-8实验检测各组细胞活力。

1.2.4 各组细胞培养上清液中TNF-α、IL-6水平及Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原水平检测 以细胞培养上清液中PICP及PⅢNP含量来分别表示心肌成纤维细胞表达Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原水平。取1.2.2中收集的各组细胞培养上清液,离心取上清,以ELISA试剂盒测量其中TNF-α、IL-6、PICP及PⅢNP水平,具体操作参照各自说明书进行。

1.2.5 免疫印迹实验检测各组细胞TGF-β/Smad通路相关蛋白表达 取1.2.2中收集的各组细胞,以高效RIPA裂解液于4 ℃裂解、离心,提取总蛋白,使用BCA蛋白浓度测定试剂盒测出其浓度,混入适量上样缓冲液,煮沸变性蛋白备用。运用SDS-PAGE凝胶制备试剂盒配制分离胶及浓缩胶,取20 μg各组蛋白加入浓缩胶上样孔中,110 V恒压下电泳后湿转,均用时约1.5 h,以5%脱脂奶粉封闭PVDF膜上蛋白,截取蛋白条带分别以兔源GAPDH、TGF-β1、Smad3、p-Smad3一抗孵育、洗膜,加入羊抗兔二抗孵育、洗膜,以增强化学发光法显影后,使用凝胶成像系统拍照,运用Quantity One软件定量分析各蛋白表达。

2 结果

2.1 不同浓度乌梅有机酸对高糖诱导的心肌成纤维细胞增殖的影响

不同浓度乌梅有机酸可抑制高糖诱导的心肌成纤维细胞增殖,并随剂量升高而作用增强,IC50为1.92 mg/ml(见图1)。

与0 mg/ml比较,*P<0.05图1 不同浓度乌梅有机酸对高糖诱导的心肌成纤维细胞增殖的影响 (n=6)Figure 1 Effects of different concentrations of organic acids from Fructus mume on proliferation of cardiac fibroblasts induced by high glucose (n=6)

2.2 各组细胞活力检测结果

与对照组相比,高糖组细胞活力明显升高(P<0.05);与高糖组相比,乌梅有机酸组细胞活力降低(P<0.05),TGF-β1组细胞活力升高(P<0.05);与乌梅有机酸组相比,乌梅有机酸+TGF-β1组细胞活力升高(P<0.05);与TGF-β1组相比,乌梅有机酸+TGF-β1组细胞活力降低(P<0.05,见表1)。

表1 不同处理后各组细胞活力Table 1 Cell viability in each group after different

2.3 各组细胞分泌炎性因子TNF-α、IL-6水平检测结果

与对照组相比,高糖组细胞分泌炎性因子TNF-α、IL-6水平明显升高(P<0.05);与高糖组相比,乌梅有机酸组细胞分泌炎性因子TNF-α、IL-6水平降低(P<0.05),TGF-β1组细胞分泌炎性因子TNF-α、IL-6水平升高(P<0.05);与乌梅有机酸组相比,乌梅有机酸+TGF-β1组细胞分泌炎性因子TNF-α、IL-6水平升高(P<0.05);与TGF-β1组相比,乌梅有机酸+TGF-β1组细胞分泌炎性因子TNF-α、IL-6水平降低(P<0.05,见表2)。

表2 不同处理后各组细胞分泌炎性因子TNF-α、IL-6水平Table 2 TNF-α and IL-6 levels secreted by the cells in each group after different

2.4 各组细胞表达Ⅰ型胶原及Ⅲ型胶原检测结果

与对照组相比,高糖组细胞表达Ⅰ型胶原及Ⅲ型胶原明显升高(P<0.05);与高糖组相比,乌梅有机酸组细胞表达Ⅰ型胶原及Ⅲ型胶原降低(P<0.05),TGF-β1组细胞表达Ⅰ型胶原及Ⅲ型胶原升高(P<0.05);与乌梅有机酸组相比,乌梅有机酸+TGF-β1组细胞表达Ⅰ型胶原及Ⅲ型胶原升高(P<0.05);与TGF-β1组相比,乌梅有机酸+TGF-β1组细胞表达Ⅰ型胶原及Ⅲ型胶原降低(P<0.05,见表3)。

表3 各组细胞表达Ⅰ型胶原及Ⅲ型胶原水平Table 3 The expression of type Ⅰ collagen and type Ⅲ collagen in cells in each

2.5 各组细胞TGF-β/Smad通路相关蛋白表达检测结果

与对照组相比,高糖组细胞TGF-β/Smad通路相关蛋白p-Smad3/Smad3、TGF-β1表达明显升高(P<0.05);与高糖组相比,乌梅有机酸组细胞TGF-β/Smad通路相关蛋白p-Smad3/Smad3、TGF-β1表达降低(P<0.05),TGF-β1组细胞TGF-β/Smad通路相关蛋白p-Smad3/Smad3、TGF-β1表达升高(P<0.05);与乌梅有机酸组相比,乌梅有机酸+TGF-β1组细胞TGF-β/Smad通路相关蛋白p-Smad3/Smad3、TGF-β1表达升高(P<0.05);与TGF-β1组相比,乌梅有机酸+TGF-β1组细胞TGF-β/Smad通路相关蛋白p-Smad3/Smad3、TGF-β1表达降低(P<0.05,见图2,3)。

图2 蛋白免疫印迹检测各组细胞TGF-β/Smad通路相关蛋白表达Figure 2 Expression of TGF-β/Smad pathway related proteins in each group by Western blotting

3 讨论

糖尿病作为一种代谢性疾病,患者因血糖长期处于高水平,而易导致DCM的发生,引发心功能障碍、心衰竭等临床症状,心肌成纤维细胞的活化增殖在其中发挥着重要作用[13,14]。高糖可诱导炎症发生,促进心肌成纤维细胞增殖,导致胶原过量沉积在细胞外,造成心肌纤维化变性[15,16]。在本实验中,高糖可导致心肌成纤维细胞活力、分泌的TNF-α、IL-6、Ⅰ型胶原及Ⅲ型胶原水平明显升高,表明高糖可诱导促炎因子过量表达,引发炎症,促使心肌成纤维细胞增殖及胶原合成,揭示本文关于研究DCM的高糖细胞模型成功建立。

与对照组相比,*P<0.05;与高糖组相比,#P<0.05;与乌梅有机酸组相比,&P<0.05;与TGF-β1组相比,△P<0.05图3 各组细胞TGF-β/Smad通路相关蛋白表达Figure 3 Expression of TGF-β/Smad pathway related proteins in each group

研究表明,抑制炎症可延缓胶原合成沉积,减轻心肌纤维化[15,16]。乌梅作为一种安全性高的重要中药材,具有镇咳、抗菌、抗病毒、抗炎、抗纤维化、抗氧化、降血脂、降血糖等多种药理作用,乌梅丸可补泻兼施、寒热并调,减轻炎症,对放射性肠炎具有很好的治疗作用[17],乌梅汤和盐酸二甲双胍合用,可增强降血糖作用,改善胰岛素抵抗症状,比各自单用疗效更好[18],乌梅有机酸是提取自乌梅的有机酸类物质,可抑制金黄色葡萄球菌生物膜的形成,发挥明显的抑菌作用[7]。本实验以0,0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0 mg/ml浓度乌梅有机酸处理高糖诱导的新生大鼠心肌成纤维细胞,发现乌梅有机酸呈剂量依赖性地抑制心肌成纤维细胞增殖,根据IC50值,选出最佳药物浓度,以此浓度再次处理上述细胞,发现乌梅有机酸可明显降低细胞活力、TNF-α、IL-6、Ⅰ型胶原及Ⅲ型胶原分泌水平,表明乌梅有机酸可抑制高糖诱导的炎性因子过表达,减少心肌成纤维细胞增殖及胶原合成分泌,缓解心肌纤维化。

TGF-β1是一种转化生长因子,具有很强的促纤维化作用,TGF-β1可激活Smad信号,增强Smad3的磷酸化,促进胶原蛋白合成,引发组织纤维化,下调TGF-β/Smad信号通路蛋白表达,可抑制心肌成纤维细胞Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原蛋白表达,防治心肌纤维化;敲除小鼠Smad3基因,可明显缓解心肌间质纤维化,减轻心肌不良重塑,修复心功能[19,20]。本实验发现,以TGF-β1处理高糖诱导的新生大鼠心肌成纤维细胞,可明显激活Smad3磷酸化,加重心肌纤维化变性,乌梅有机酸可下调细胞TGF-β1表达及p-Smad3/Smad3,而以乌梅有机酸和TGF-β1联合处理高糖诱导的新生大鼠心肌成纤维细胞,可逆转TGF-β1加重心肌细胞纤维化的作用,并减弱乌梅有机酸对心肌细胞纤维化的改善作用,表明乌梅有机酸可通过下调TGF-β/Smad信号通路延缓心肌纤维化。

综上所述,乌梅有机酸可逆转高糖诱导的促炎因子和胶原蛋白表达上调,减轻炎症,抑制细胞外基质沉积,缓解心肌细胞纤维化,为临床DCM的治疗提供了新的参考,下调TGF-β/Smad通路是其药理机制之一。但本研究只在细胞水平上进行了研究,存在一定不足,后续还需动物实验进行进一步验证,进而推广到临床治疗中。