基于钙超载研究滇乌碱诱导大鼠心律失常的毒性机制

张祉思 程婉秋 江涛 沈志滨 陈艳芬 陈聪 司徒莹 唐春萍

中圖分类号 R285 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2021）23-2854-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.23.07

摘 要 目的：研究滇乌碱诱导大鼠心律失常的毒性机制。方法：将32只大鼠按随机数字表法随机分为正常对照组，滇乌碱低、高剂量组（0.09、0.14 mg/kg）和乌头碱组（阳性对照，0.88 mg/kg），每组8只。各给药组大鼠每天灌胃相应药物1次，正常对照组大鼠灌胃等体积生理盐水，连续7 d。末次灌胃后，观察各组大鼠的心电图变化，测定大鼠心肌组织中腺苷三磷酸（ATP）含量、心肌细胞中Ca2+含量、心肌组织中Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性以及雷诺定受体2（RyR2）、Ca2+-ATP酶（SERCA2）蛋白表达水平。结果：与正常对照组比较，滇乌碱低剂量组大鼠QRS波时限、校正后QT期间（QTc间期）均显著延长（P<0.01），心肌细胞中Ca2+含量显著升高（P<0.05），心肌组织中ATP含量、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性、Na+-K+-ATP酶活性和SERCA2蛋白表达水平均显著降低（P<0.05或P<0.01）;滇乌碱高剂量组和乌头碱组大鼠心率均显著增快（P<0.05或P<0.01），QRS波时限、QTc间期均显著延长（P<0.01），心肌细胞中Ca2+含量均显著升高（P<0.01），心肌组织中ATP含量、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性、Na+-K+-ATP酶活性和RyR2、SERCA2蛋白表达水平均显著降低（P<0.01）。结论：滇乌碱可导致大鼠心律失常;其作用机制可能与降低心肌组织中Ca2+-Mg2+-ATP酶、Na+-K+-ATP酶活性，下调心肌组织中钙转运相关蛋白RyR2、SERCA2的表达，从而导致Ca2+超载有关。

关键词 滇乌碱;心律失常;钙超载;腺苷三磷酸;雷诺定受体2;Ca2+-ATP酶;毒性机制

Study on the Toxicity Mechanism of Yunaconitine-induced Arrhythmia in Rats Based on Calcium Overload

ZHANG Zhisi1，CHENG Wanqiu1，JIANG Tao2，SHEN Zhibin1，CHEN Yanfen1，CHEN Cong1，SITU Ying1，TANG Chunping1，3（1.School of Traditional Chinese Medicine， Guangdong Pharmaceutical University， Guangzhou 510006， China; 2. Laboratory Animal Center， Guangdong Pharmaceutical University， Guangzhou 510006， China; 3. Guangdong Engineering Research Center for Local Precise Drug Delivery， Guangzhou 510006， China）

ABSTRACT   OBJECTIVE： To study the toxicity mechanism of yunacotine-induced arrhythmia in rats. METHODS： Totally 32 rats were randomly divided by random number table method into normal control group， yunacotine low-dose and high-dose groups （0.09， 0.14 mg/kg）， aconitine group （positive control， 0.88 mg/kg）， with 8 rats in each group. Administration groups were given the corresponding drugs once a day， and normal control group was given the constant volume of normal saline， for consecutive 7 d. After last intragastric administration， the changes of electrocardiogram （ECG） were observed. The contents of adenosine triphosphate （ATP） in myocardial tissue and Ca2+ in myocardial cells， the activities of Na+-K+-ATPase and Ca2+-Mg2+-ATPase as well as the protein expression of ranolidine receptor 2 （RyR2） and Ca2+-ATPase （SERCA2） in myocardial tissue were determined. RESULTS： Compared with normal control group， time limit of QRS wave and QTc intervals of rats were prolonged significantly in yunaconitine low-dose group （P<0.01）. The content of Ca2+ in myocardial cells， the ATP contents， the activities of Ca2+-Mg2+-ATPase and Na+-K+-ATPase as well as the protein expression of SERCA2 in myocardial tissue were reduced significantly （P<0.05 or P<0.01）. The heart rate of rats in yunaconitine high-dose group and aconitine group were increased significantly （P<0.05 or P<0.01）， and time limit of QRS wave and QTc intervals were significantly prolonged （P<0.01）; the content of Ca2+ in myocardial cells was increased significantly （P<0.01）; ATP content， the activities of Ca2+-Mg2+-ATPase and Na+-K+-ATPase， and protein expression of RyR2 and SERCA2 in myocardial tissue were decreased significantly （P<0.01）. CONCLUSIONS： Yunaconitine can induce arrhythmia in rats， the mechanism of which may be associated with Ca2+ overload that resulted from reducing the activities of Na+-K+-ATPase and Ca2+-Mg2+-ATPase and down-regulating the expression of related calcium transporter RyR2 and SERCA2.

KEYWORDS   Yunaconitine; Arrhythmia; Calcium overload; Adenosine triphosphate; Ryanodine receptor 2; Ca2+ ATPase; Toxicity mechanism

黄草乌Aconitum vilmorinianum Kom.为毛莨科乌头属多年生草本植物的干燥块根[1]，具有祛风散寒、活血止痛的功效，临床用于治疗风寒湿痹、跌打损伤和风湿关节疼痛等[2]，被收载于2005年版《云南省中药材标准》[3]。本课题组前期研究发现，黄草乌及其炮制品都有明显的镇痛作用，但其毒性剂量和疗效剂量接近，限制了其在临床的广泛使用[4]。滇乌碱是从黄草乌中提取、分离得到的主要药效成分，但也是毒性成分[5]。温玉莹等[6]的研究结果顯示，黄草乌经十二指肠给药后，小鼠心律失常的发生率为100%。黎虽宇等[7]研究发现，黄草乌生品能使大鼠出现室性早搏等心律失常现象;而黄草乌经炮制后，生物碱含量减少，且对大鼠心电图的各项指标也无明显影响，提示黄草乌炮制前后诱导大鼠心律失常的毒性差异可能与滇乌碱含量变化有关。然而，关于滇乌碱诱导心律失常的毒性机制仍未明确。

心律失常是最常见的心血管疾病，是主要由于心脏冲动起源部位、兴奋秩序以及传导速度异常而引起的心脏搏动频率与节律障碍。心律失常不仅会加重原有心脏疾病的进展（如加速心力衰竭），而且也是导致患者发生猝死的重要原因之一[8]。Ca2+不仅是维持心脏电活动的关键因素，也是引发心肌收缩的直接激活剂，因此任何引起Ca2+含量波动的因素都会影响心肌兴奋-收缩偶联（ECC）过程，最终导致心律失常[9]。基于此，本研究拟从整体动物水平观察滇乌碱对大鼠心电图的影响，并探究其对腺苷三磷酸（ATP）含量及Ca2+-Mg2+-ATP酶活性、Na+-K+-ATP酶活性、心肌细胞中Ca2+含量、钙转运相关蛋白表达水平的影响，进一步揭示滇乌碱诱导心律失常的毒性机制，为黄草乌的临床安全使用提供实验依据。

1 材料

1.1 主要仪器

本研究所用主要仪器有BL-420F型生物信号采集处理系统（成都泰盟软件有限公司），Infinite 200 PRO型多功能荧光酶标仪（奥地利Tecan Austria GmbH公司），HZT-A1000型电子天平（福州华志科学仪器有限公司），3100型CO2培养箱（广州市源起生物科技有限公司），Mini型蛋白电泳系统（美国Bio-Rad公司），LG2000型数码凝胶图像分析系统（杭州朗基科学仪器有限公司）。

1.2 主要药品与试剂

滇乌碱对照品（批号MUST17102101，纯度≥98%）、乌头碱对照品（批号MUST17110910，纯度≥98%）均购自成都曼斯特生物科技有限公司;ATP含量测定试剂盒（批号20200712）、ATP酶活性测定试剂盒（批号20200628）和二喹啉甲酸（BCA）蛋白浓度测定试剂盒（批号20200723）均购自南京建成生物工程研究所;Fluo-3/AM Ca2+荧光探针（批号75400150）购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司;兔源雷诺定受体2（RyR2）单克隆抗体（批号GR3200692-1）购自美国Proteintech公司;兔源Ca2+-ATP酶（SERCA2）单克隆抗体（批号GR3182873-9）、兔源3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）单克隆抗体（批号GR3250452-7）均购自英国Abcam公司;山羊抗兔辣根过氧化物酶（HRP）标记的免疫球蛋白G（IgG）抗体（批号GR3321256-8）购自美国Bioworld公司;超敏ECL化学发光即用型底物（批号B347825E）购自美国Boster公司;其余试剂均为分析纯，水为双蒸水。

1.3 动物

本研究所用动物为SPF级SD大鼠，共32只，雌雄各半，体质量为240～260 g，由广东省医学实验动物中心提供，实验动物生产许可证号为SCXK（粤）2018-0002、质量合格证号为44007200078479。大鼠购入后饲养于广东药科大学实验动物中心SPF级动物房中[实验动物使用许可证号为SYXK（粤）2017-0125]。实验室环境温度为20～25 ℃，相对湿度为40%～70%，12 h照明/12 h黑暗循环。本实验动物方案已获得广东药科大学实验动物伦理委员会批准。

2 方法

2.1 分组与给药

采用随机数字表法将32只大鼠随机分为正常对照组，滇乌碱低、高剂量组（0.09、0.14 mg/kg）和乌头碱组（阳性对照，0.88 mg/kg），每组8只。各给药组大鼠的给药剂量是参考文献[10-11]及前期预实验结果设置，其中滇乌碱低、高剂量分别为大鼠的1/6、1/4半数致死量（LD50），乌头碱的剂量为大鼠的1/10 LD50。各给药组大鼠灌胃相应药物（均以生理盐水为溶剂溶解），正常对照组大鼠灌胃等体积的生理盐水;灌胃体积均为10 mL/kg，每天1次，连续7 d。

2.2 心电图观察

末次灌胃1 h后，腹腔注射3%水合氯醛（10 mL/kg）将大鼠麻醉，然后将大鼠按仰卧位固定，并将正向电极插入其右上肢，负向电极插入其左下肢，底线插入其右下肢，然后使用生物信号采集系统采集大鼠60 min内的Ⅱ导联心电图，记录并分析其心率、QRS波、PR间期以及校正后QT间期（QTc间期）的变化。其中，QTc间期是根据公式QTc=QT/RR1/2计算得到（RR为标准化的心率值，根据60除以心率得到）[6]。

2.3 标本采集与处理

记录大鼠的心电图后，将大鼠处死，打开其胸腔，在无菌条件下迅速剥离其心脏。心脏用生理盐水冲洗，并用滤纸吸干，置于-80 ℃冰箱中保存，备用。

2.4 心肌组织中ATP含量测定

称取心肌组织样本0.1 g，以水制成100 g/L的匀浆液后，置于沸水浴中煮10 min;取出，涡旋混匀1 min，然后以3 500 r/min离心10 min，取上清液。根据ATP含量测定试剂盒说明书方法操作，通过酶标仪测定各组大鼠心肌组织中ATP的含量。

2.5 心肌组织中Ca2+-Mg2+-ATP酶、Na+-K+-ATP酶活性测定

称取心肌组织样本0.1 g，以水制成100 g/L的匀浆液，按照ATP酶活性测定试剂盒说明书方法操作，测定大鼠心肌组织中Ca2+-Mg2+-ATP酶、Na+-K+-ATP酶活性。采用BCA法测定各组大鼠心肌组织匀浆液的蛋白浓度，ATP酶的活力单位以每小时每毫克蛋白分解ATP产生无机磷的量（μmol Pi/mg prot/h）表示。

2.6 心肌细胞中Ca2+含量测定

称取心肌组织样本约50 mg，加入水充分研磨，于300目尼龙网上过滤得到细胞悬液;以1 000 r/min离心5 min，收集细胞沉淀。以磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗细胞2遍，随后加入含有5 μmol/L Fluo-3/AM Ca2+荧光探针的无血清DMEM培养基5 mL，再加入1 μL 25%Pluronic F127，置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养1 h;取出，以     1 000 r/min离心5 min，以PBS洗涤3次，洗脱未负载的Fluo-3/AM Ca2+荧光探针;然后使用酶标仪在激发波长488 nm、发射波长530 nm处检测大鼠心肌细胞中Ca2+的荧光强度（荧光强度越高代表Ca2+的含量越高）。

2.7 心肌组织中RyR2、SERCA2蛋白表达测定

每组随机选取3只大鼠的心肌组织样本，采用Western blot法进行测定。称取心肌组织样本约100 mg，加入裂解液提取总蛋白;以BCA法进行蛋白定量分析，然后将蛋白高温变性。取变性后的蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离（分离胶电压为100～200 V，浓缩胶电压为60～100 V，电泳时间为60 min），随后湿法转至聚偏二氟乙烯膜（转膜电流均为300 mA，RyR2蛋白的转膜时间为130 min，SERCA2蛋白的转膜时间为90 min）;以5%脱脂奶粉封闭1 h后，加入RyR2一抗（稀释比例为1 ∶ 2 000）、SERCA2一抗（稀释比例为1 ∶ 3 000）、GAPDH一抗（稀释比例为1 ∶ 10 000），于4 ℃孵育过夜;以TBST漂洗6次、每次5 min，加入HRP标记的IgG二抗（稀释比例为1 ∶ 40 000），于室温孵育1 h;以TBST漂洗6次、每次5 min，加入ECL显色，于化学发光成像仪中成像。采用Image J v1.8.0软件测定各蛋白条带的灰度值，以各目的蛋白条带与内参GAPDH蛋白条带的灰度值比值表示目的蛋白的表达水平。

2.8 统计学方法

采用SPSS 21.0软件进行统计分析。实验数据以x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两兩比较采用LSD-t检验。检验水准α=0.05。

3 结果

3.1 滇乌碱对大鼠心电图的影响

正常对照组大鼠保持窦性心律。与正常对照组比较，滇乌碱低剂量组大鼠QRS波时限和QTc间期均显著延长（P<0.01），以产生室性期前收缩的心电图变化为主;滇乌碱高剂量组大鼠心率显著增快（P<0.05），QRS波时限和QTc间期均显著延长（P<0.01），主要表现为双向性室性心动过速;乌头碱组大鼠的心率显著增快（P<0.01），QRS波时限和QTc间期均显著延长（P<0.01），主要表现为单形性室性心动过速等心电异常。与乌头碱组比较，滇乌碱低、高剂量组大鼠心电图各参数的差异均无统计学意义（P>0.05）。各组大鼠的心电图见图1，心电图各参数测定结果见表1。

3.2 滇乌碱对大鼠心肌组织中ATP含量的影响

与正常对照组比较，滇乌碱低、高剂量组和乌头碱组大鼠心肌组织中ATP含量均显著降低（P<0.05或P<0.01）。与乌头碱组比较，滇乌碱低、高剂量组大鼠心肌组织中ATP含量差异均无统计学意义（P>0.05）。各组大鼠心肌组织中ATP含量测定结果见表2。

3.3 滇乌碱对大鼠心肌组织中ATP酶活性的影响

与正常对照组比较，滇乌碱低、高剂量组和乌头碱组大鼠心肌组织中Ca2+-Mg2+-ATP酶、Na+-K+-ATP酶活性均显著降低（P<0.05或P<0.01）。与乌头碱组比较，滇乌碱低、高剂量组大鼠心肌组织中上述ATP酶活性差异均无统计学意义（P>0.05）。各组大鼠心肌组织中ATP酶活性测定结果见表2。

3.4 滇乌碱对大鼠心肌细胞中Ca2+含量的影响

与正常对照组比较，滇乌碱低、高剂量组和乌头碱组大鼠心肌细胞中Ca2+含量均显著升高（P<0.05或P<0.01）。与乌头碱组比较，滇乌碱低、高剂量组大鼠心肌细胞中Ca2+含量差异均无统计学意义（P>0.05）。各组大鼠心肌细胞中Ca2+含量测定结果见表2。

3.5 滇乌碱对大鼠心肌组织中RyR2、SERCA2蛋白表达的影响

与正常对照组比较，滇乌碱低剂量组大鼠心肌组织中SERCA2蛋白表达水平显著降低（P<0.01），但RyR2蛋白表达水平差异无统计学意义（P>0.05）;滇乌碱高剂量组和乌头碱组大鼠心肌组织中RyR2、SERCA2蛋白表达水平均显著降低（P<0.01）。与乌头碱组比较，滇乌碱低剂量组大鼠心肌组织中SERCA2蛋白表达水平差异无统计学意义（P>0.05），RyR2蛋白表达水平显著升高（P<0.05）;滇乌碱高剂量组大鼠心肌组织中RyR2蛋白表达水平差异无统计学意义（P>0.05），SERCA2蛋白表达水平显著升高（P<0.05）。各组大鼠心肌组织中RyR2、SERCA2蛋白表达的电泳图见图2，蛋白表达水平测定结果见表3。

4 讨论

心电图记录了心脏兴奋的产生、传导、恢复过程中的生物电变化，在临床中反映了患者的心脏功能，是监测、诊断心血管疾病的重要指标之一[12]。QRS波是心室除极波，QRS波群时限延长可能与室性异位激动产生的心室除极有关[13]。PR间期代表由窦房结产生的兴奋经由心房、房室交界和房室束到达心室并引起心室开始兴奋所需要的时间，若PR间期异常，则提示兴奋传导异常;QTc间期延长可导致室性心律失常的发生，在诊断某些心律失常和判断心肌梗死患者预后等方面有着重要的临床意义[14]。由于乌头碱是乌头属植物最主要的心脏毒性物质，能引起多种心律失常，故可作为乌头属植物毒性成分的典型代表[15]。因此，本研究以乌头碱为阳性对照药物来考察滇乌碱致大鼠心律失常的毒性作用。心电图观察结果显示，给予不同剂量的滇乌碱后，大鼠的心率不同程度地加快，QRS波时限和QTc间期不同程度地延长，并且出现了室性早搏、室性心动过速等心律失常现象。

细胞内Ca2+作为第二信使，可以介导以膜电位变化为特征的兴奋过程和以肌丝滑行为基础的收缩过程，即ECC过程;若细胞内Ca2+浓度异常，可导致心脏传导速度减慢、心室收缩功能减弱，从而影响心脏功能的正常发挥[16]。Na+-K+-ATP酶又称钠泵，是广泛存在于心肌及其他组织细胞膜上的一种糖蛋白，也是一种能催化ATP水解的酶，这种泵每消耗1分子 ATP所释放的能量就可逆浓度将3个Na+泵出细胞外，同时将2个K+泵入细胞内;一旦Na+-K+-ATP酶活性降低，就会造成细胞内Na+浓度过高，间接促进Na+-Ca2+交换，从而引起细胞内Ca2+超载，导致心肌的兴奋-收缩功能紊乱[17]。Ca2+-Mg2+-ATP酶又称钙泵，能够利用水解ATP释放的能量驱动细胞内Ca2+泵出细胞，以维持细胞内低浓度的游离Ca2+;当Ca2+-Mg2+-ATP酶活性受到抑制时，容易导致心肌游离Ca2+浓度过高，而Ca2+超载程度与心肌损伤程度呈正相关[18]。心肌细胞中过多的Ca2+以磷酸盐的形式沉积，引起线粒体氧化磷酸化的电子传递功能障碍，造成ATP合成受阻，导致能量无法转化成ATP为心肌所用，进一步抑制ATP酶活力，形成“ATP合成障碍-Ca2+超载”的恶性循环，从而诱导心律失常发生[19]。本研究结果显示，给予不同剂量滇乌碱后，大鼠心肌组织中ATP含量不同程度地减少，心肌细胞中Ca2+含量不同程度地增加，心肌组织中Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性不同程度地降低。这提示Ca2+超载可能是滇乌碱致大鼠心律失常的毒性机制之一。

在ECC过程中，相关钙转运蛋白的调控紊乱会导致胞浆Ca2+负载和肌浆网中Ca2+释放失调，这也是引起Ca2+依赖型心律失常的关键因素[20]。RyRs又称兰尼碱受体，是位于肌浆网中的一种选择性阳离子通道。据文献报道，RyRs有3种亚型，其中RyR2是主要的Ca2+释放通道，主要分布于心肌，对细胞质内游离Ca2+的浓度影响尤为显著：正常情况下，当兴奋冲动传导至心肌细胞时，L型Ca2+通道开放，然后细胞外少量的Ca2+内流，而短时间内迅速升高的游离Ca2+浓度会增加RyR2对Ca2+的敏感性，使RyR2被激活并同步释放大量Ca2+，引起心肌收缩[21]。但游离Ca2+在胞浆内对RyR通道具有双向调节作用：当Ca2+处于低浓度（0.01～1 mmol/L）时，可以刺激并激活RyR2通道;当细胞内的Ca2+浓度达到1 mmol/L时，RyR2通道的开放程度达到最大;此时若Ca2+浓度继续升高（>1 mmol/L），心肌组织为避免过长或过强的收缩，则会抑制RyR2通道开放[22]。在ECC过程中，待心肌细胞处于舒张期后，广泛表达于真核细胞肌浆网中的SERCA2则可以利用ATP供能，驱动胞浆内Ca2+重新泵入钙库中，从而降低胞浆中Ca2+浓度，以维持细胞内外Ca2+的动态平衡，同时为心肌细胞的下一次收缩储存足够的Ca2+量[23]。本研究结果显示，给予不同剂量滇乌碱后，大鼠心肌组织中RyR2、SERCA2蛋白表达均不同程度地下调，表明滇乌碱可造成肌浆网对Ca2+的再摄取功能障碍，从而导致Ca2+超载，使心肌细胞丧失自律性、兴奋性、传导性等生理功能，最终引起病理状态下心肌收缩、舒张功能的障碍。

综上所述，滇乌碱可导致大鼠心律失常;其毒理学机制可能与降低心肌组织中Ca2+-Mg2+-ATP酶、Na+-K+-ATP酶活性，下调心肌组织中钙转运相关蛋白RyR2、SERCA2的表达，从而导致Ca2+超载有关。

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（收稿日期：2021-07-20 修回日期：2021-10-20）

（编辑：林 静）