血清微小核糖核酸-599 与肝细胞肝癌TACE 治疗预后的相关性

王 奕， 韩 涛， 张志强， 崔 刚， 廖 搴， 蔡恒烈

肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是全球第二大恶性肿瘤，严重危害着人们健康。 中国是HCC 的高发国家，发病人数约占全球HCC 患者总数的 55%［1］。 目前，尽管针对 HCC 的诊断及治疗取得了一定进展， 但HCC 患者的5 年总生存率仍不足10%［2］。 有研究指出，对于相同肿瘤分期的 HCC，经肝动脉化疗栓塞（transhepaticarterialchemoembolization，TACE）的治疗效果存在一定差异［3］。因此，早期评价HCC 治疗效果，不仅可节约医疗资源，还可达到精准治疗的目的［3］。 文献报道，微小核糖核酸-599（miR-599）参与了甲状腺乳头状癌［4］、神经胶质瘤［5］和膀胱尿路上皮癌［6］等发病和进展过程，并与预后有关。此外，miR-599 还可调节HCC 细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移等过程［7-8］。 本研究选取 TACE 治疗的 HCC患者作为研究对象， 分析miR-599 与预后的关系，以期为改善HCC 预后提供帮助。

1 材料与方法

1.1 一般资料

纳入 2016 年6 月至 2018 年 2 月在江西省萍乡市人民医院确诊并接受治疗的166 例HCC 患者，男 108 例，女 58 例；年龄为（62.2±4.7）岁，范围为 48～70 岁。 Child-Pugh A 级 124 例，B 级 42 例；HBsAg 阳性 137 例，阴性 29 例；甲胎蛋白≤400 μg/L 69 例，＞400 μg/L 97 例；肿瘤单发 63 例，多发 103 例；肿瘤直径≤5 cm 87 例，＞5 cm 79 例；肿瘤分期：Ⅰb期 16 例，Ⅱ期 70 例，Ⅲa 期 80 例；TACE 次数：1 次111 例，2 次 26 例，3 次 29 例；索拉非尼：接受 19 例，未接受 147 例；血管侵犯：有 80 例，无 86 例。 HCC诊断参照《原发性肝癌诊疗规范（2019 年版）》［9］，有典型的肝癌影像学表现，病灶＞2 cm 或肝占位性病灶经病理组织学或细胞学检查证实。 纳入标准：①年龄＜80 岁；②接受TACE 治疗；③签署了知情同意书。 排除标准：①Child-Pugh C 级；②临床信息不完整；③合并其他恶性肿瘤；④合并血液系统疾病；⑤获取血液样本前接受了放化疗、靶向治疗或免疫治疗等。

所有研究对象对研究内容知情同意，签署知情同意书。 本研究经江西省萍乡市人民医院医学伦理委员会批准（2016R-239KS）。

1.2 TACE 治疗方案

术前检查所有受试者血常规、尿常规、凝血功能等。 手术步骤：消毒、铺巾，行局部麻醉，采用Seldinger 法由股动脉入路插入导管至腹腔动脉或肝总动脉，行血管造影检查，明确癌组织的供血情况；将化疗药奥沙利铂（江苏奥赛康药业股份有限公司，国药准字：H20064296，100 mg/m2）和 5-氟尿嘧啶（上海旭东海普药业有限公司， 国药准字：H31020593，500 mg/m2）稀释，缓慢灌注至癌组织的供血动脉，用乳化充分的超液化碘油（烟台鲁银药业有限公司，国药准字：H37022398）和阿霉素（瀚晖制药有限公司，国药准字：H33021980，40 mg/m2）的混悬液栓塞，注入明胶海绵颗粒［杭州艾力康医药科技有限公司，国食药监械（准）字2014 第3771056 号］栓塞，直至癌组织供血动脉呈“干树枝”状；拔出导管和导管鞘，局部加压止血。术后给予保肝、止吐等药物治疗，医嘱术后4 周复诊，行CT 检查，根据癌组织坏死情况制定后续治疗方案，TACE 后肿瘤复发的患者，再次给予TACE 治疗；TACE 治疗无效的患者，联合消融（本研究中不包含接受消融治疗的患者）或靶向药物。

1.3 miR-599 表达量检测

实时荧光定量 PCR 检测血清 miR-599 表达量［10］。抽取受试者TACE 术前1 d 和术后28 d 肘部静脉血10 mL，离心后吸取上清液，置于 EP 管中，-80℃冰箱中保存。 实验步骤：取冻存的血清，解冻后用TRIzol 试剂（日本 Takara 公司）提取总 RNA，用 752型紫外分光光度计（上海光学仪器五厂有限公司）检测RNA 纯度； 用反转录试剂盒（日本TaKaRa 公司）将 RNA 反转录为 cDNA；用 Q1600 型 PCR 仪（杭州柏恒科技有限公司）扩增产物，条件为95 ℃10 min，95 ℃ 60 s，35 个循环，60 ℃ 60 s，72 ℃ 60 s。miR-599 上游序列：5'-TAAGCTGACATGGGACAGG GAT- 3'， 下 游 序 列 ：5'- CTCCATATCGCACTTTA ATCTCTAACT-3'； 内参 U6 上游序列：5'-CTCGCT TCGGCAGCACA-3'， 下游序列：5'-ACGCTTCACGA ATTTGCGT-3'。 选取同期参加体检的20 名年龄、性别与HCC 患者匹配的健康人的样本作为对照，用2-DDct法计算HCC 患者血清中miR-599 的相对表达量。

1.4 随访

采用复诊和电话随访方式获取受试者3 年生存结局，于受试者出院后1 个月复诊，此后每3～6个月随访 1 次， 末次随访时间为2021 年 2 月 23日，中位随访时间为36（6～36）个月。

1.5 统计学方法

应用SPSS 23.0 软件包进行统计分析。 正态分布的计量资料以表示，2 组间比较采用独立样本t 检验，TACE 前、后 miR-599 的相对表达量比较用重复测量方差分析；非正态分布的计量资料以M（Q1，Q3）表示，2 组间比较采用 Mann-Whitney U 检验。计数资料以例数表示，组间比较采用χ2检验。用受试者工作特征（receiver operating characteristics，ROC）曲线下面积评价miR-599 诊断HCC 预后的价值。用Cox 回归分析miR-599 与TACE 治疗HCC预后的关系。 P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 生存组和死亡组患者临床特征比较

根据HCC 患者的3 年生存结局将其分为生存组113 例和死亡组53 例。 生存组和死亡组的年龄、性别构成、HBsAg、肿瘤数目和接受TACE 治疗次数构成比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05）；生存组的 Child-Pugh A 级、AFP≤400 μg/L、肿瘤直径≤5 cm、 肿瘤分期Ⅰb 期和接受索拉非尼治疗的例数均高于死亡组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。见表1。

按1∶1 倾向性评分匹配（最邻近原则）后，生存组和死亡组的年龄、 性别构成、Child-Pugh 分级、HBsAg、AFP、肿瘤数目、肿瘤直径、肿瘤分期和接受TACE 治疗次数比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05）。 见表 1。

表1 生存组和死亡组患者的临床特征比较

2.2 生存组和死亡组患者miR-599 相对表达量比较

生存组和死亡组患者miR-599 相对表达量差异有统计学意义（F=66.799，P＜0.01），生存组术前、术后的miR-599 相对表达量均高于死亡组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；术前、术后的 miR-599 相对表达量差异有统计学意义（F=232.151，P＜0.01），生存组和死亡组的术后miR-599 相对表达量均较术前升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）；生存结局和时间之间无交互作用（F=3.843，P=0.052）。 见表 2。

按1∶1 倾向性评分匹配（最邻近原则）后，生存组和死亡组的miR-599 相对表达量差异有统计学意义（F=12.267，P=0.001），生存组术前、术后的 miR-599 相对表达量均高于死亡组， 差异均有统计学意义（P＜0.05）；术前、术后的 miR-599 相对表达量差异有统计学意义（F=37.369，P＜0.01），生存组和死亡组的术后miR-599 相对表达量均较术前升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）；生存结局和时间之间无交互作用（F=1.258，P=0.269）。 见表 2。

表2 生存组和死亡组患者miR-599 相对表达量比较

2.3 miR-599 诊断HCC 预后的价值分析

术前miR-599 诊断HCC 预后的ROC 曲线下面积高于术后miR-599，差异有统计学意义（Z=2.603，P=0.009），见表 3。

按1∶1 倾向性评分匹配（最邻近原则）后，术前miR-599 诊断 HCC 预后的ROC 曲线下面积高于术后miR-599，但差异无统计学意义（Z=0.961，P=0.337），见表 3。

表3 miR-599 诊断HCC 预后的价值分析

2.4 HCC 生存预后的Cox 回归分析

将HCC 预后作为因变量，将年龄、性别、Child-Pugh 分级、HBsAg、AFP、肿瘤数目、肿瘤直径、肿瘤分期、TACE 次数、 接受索拉非尼治疗和术前miR-599 作为自变量，分别纳入Cox 回归分析，结果显示Child-Pugh 分级、AFP、肿瘤直径、肿瘤分期和术前miR-599 与 HCC 预后有关（P＜0.05）。 将 HCC 预后作为因变量，将Child-Pugh 分级、AFP、肿瘤直径、肿瘤分期、 术前miR-599 和接受索拉非尼治疗作为自变量（纳入标准为单因素Cox 回归分析的P＜0.10 或已知与HCC 生存预后有关），一并纳入Cox 回归分析， 结果显示肿瘤直径＞5 cm 和肿瘤分期高是HCC 预后的独立危险因素（P＜0.05），接受索拉非尼治疗和术前miR-599 表达量高是HCC 预后的独立保护因素（P＜0.05）。 见表 4。

表4 HCC 生存预后的Cox 回归分析结果（倾向性评分匹配前）

按1∶1 倾向性评分匹配（最邻近原则）后，将HCC预后作为因变量， 将年龄、 性别、Child-Pugh 分级、HBsAg、AFP、肿瘤数目、肿瘤直径、肿瘤分期、TACE次数和术前miR-599 作为自变量（1∶1 倾向性评分匹配后不包含接受索拉非尼治疗的患者）， 分别纳入Cox 回归分析，结果显示术前miR-599 与HCC 预后有关（P＜0.05）。将HCC 预后作为因变量，将肿瘤数目、肿瘤分期和术前miR-599 作为自变量一并纳入Cox 回归分析， 结果显示术前miR-599 表达量高是HCC 预后的独立保护因素（P＜0.05）。 见表 5。

表5 HCC 生存预后的Cox 回归分析结果（倾向性评分匹配后）

3 讨论

目前，已有多数miRNA 被报道与HCC 预后有关，如 miR-542-3p、miR-139 和 miR-100-5p 等［11-13］。本研究主要分析血清miR-599 与TACE 治疗HCC 预后的关系。 既往文献报道，接受TACE 治疗的HCC患者3 年生存率为72.12%［14］，本研究中接受 TACE治疗的HCC 患者3 年生存率为68.07%， 存在一定差异，其原因可能与样本量大小、肿瘤分期构成等有关。

为避免混杂因素影响统计分析结果的准确性，本研究采用最邻近原则进行了1∶1 倾向性评分匹配，从生存组和死亡组中抽选临床特征匹配的42 例患者进行比较。 结果显示，生存组和死亡组患者术后miR-599 相对表达量均较术前升高， 提示miR-599相对表达量与TACE 治疗有关； 且生存组术前、术后的miR-599 相对表达量均高于死亡组， 提示术前、术后的miR-599 相对表达量与TACE 治疗HCC预后有关，是HCC 预后评估的潜在生物标志物。 本研究构建了术前、 术后的miR-599 诊断HCC 预后的ROC 曲线，结果显示术前miR-599 诊断HCC 预后的ROC 曲线下面积高于术后miR-599，提示术前miR-599 诊断HCC 预后的价值较术后miR-599 高；按1∶1 倾向性评分匹配（最邻近原则）后，虽术前和术后的miR-599 诊断HCC 预后的ROC 曲线下面积差异无统计学意义， 但术前miR-599 诊断HCC预后的ROC 曲线下面积高于术后miR-599，因此认为术前miR-599 对HCC 预后评估有一定价值。

本研究用Cox 回归分析了HCC 预后的风险因素， 结果显示术前miR-599 是HCC 生存预后的独立保护因素；按1∶1 倾向性评分匹配（最邻近原则）后， 结果亦显示术前miR-599 表达量高仍是HCC预后的独立保护因素。 推测其原因有以下两点：一是过表达miR-599 可靶向MYC 抑制 HCC 细胞增殖、迁移和侵袭［7］；二是过表达 miR-599 可靶向富含丝氨酸/精氨酸剪接因子2 抑制HCC 细胞活力、迁移和侵袭，促进细胞周期停滞和凋亡［8］，miR-599 表达量与HCC 细胞的增殖、 凋亡、 侵袭和迁移等有关，进而可反映HCC 患者TACE 治疗获益。

既往研究结果显示， 肿瘤直径和肿瘤分期与HCC 生存预后独立相关［15-16］。本研究结果也显示，肿瘤直径＞5 cm 和肿瘤分期高是HCC 生存预后的独立危险因素， 接受索拉非尼治疗是HCC 生存预后的独立保护因素，与上述报道结果一致。按1∶1 倾向性评分匹配（最邻近原则）后，结果显示肿瘤直径＞5 cm 和肿瘤分期高并非HCC 生存预后的独立危险因素，推测该差异可能与倾向性评分匹配后样本量小有关，后续还需增大样本量，进一步进行分析。

综上所述， 术前 miR-599 与 HCC 患者 TACE治疗预后有关，其表达量低提示预后不良风险高。 本研究尚存在一定不足， 如仅分析了血清miR-599 与TACE 治疗的HCC 患者预后的关系，未分析其与接受其他治疗方案的HCC 患者预后的关系， 后续将开展大样本、多中心研究进行分析，以充实本研究结论。