UPLC-Q/Orbitrap HRMS测定白酒中氨基甲酸乙酯含量的不确定度分析

杨军林，程平言，蒋力力，冯小兵，熊晓通，尹艳艳，胡 峰，汪地强，钟方达

（贵州茅台酒厂（集团）习酒有限责任公司, 贵州遵义 564622）

氨基甲酸乙酯（Ethyl Carbamate，EC）作为广泛存在于发酵食品（乳酪、面包、酸奶等）和酒精饮料（葡萄酒、威士忌、蒸馏酒）中的2A类致癌物质[1-3]，是威胁饮酒人群健康安全的潜在因素之一；其次，在肝脏清除上，乙醇与EC很有可能存在较为复杂的交互反应，故摄入体内的乙醇与EC具有一定的协同致癌效果[4]；还有证据表明，长期接触EC可能会导致神经系统紊乱[5-6]。因此，目前有些国家已制定了EC在蒸馏酒中的相关限量标准[7-8]；但国内尚未制定白酒中EC的相关限量标准，为了有效监测白酒中EC含量问题，白酒生产企业及部分科研院所相继开发了薄层色谱法、傅里叶变换近红外光谱法、气相色谱法、气相色谱-质谱法、高效液相色谱-荧光检测器法以及高效液相色谱-质谱法等监测手段[9]。为了确保实验检测结果的可信度，对其进行测量不确定度的分析具有必要性，目前仅有气质联用法的不确定度评价方法已见报道[10]，而高效液相色谱-质谱法测定白酒中EC时具有前处理操作简便、抗干扰能力强等优点[11-16]，但对其不确定度的评价研究尚属于空白，同时，考虑了将实验准确度和精密度作为不确定度的来源之一。

为了客观公正地表示测定结果，需要引入测量不确定度，测量不确定度分析是实验检测过程和实验室质量控制中的必要部分，同样，此举也具有相当重要的意义。测量不确定度可有效表征合理地赋予被测量值的分散性，并可对实验检验结果进行合格判定，同样，也可用于开发新检测方法、实验室认证等方面[17-30]。本研究依据GB/T 27148-2017《测量不确定度评定与表示》[31]和JJF 1135-2005《化学分析测量不确定度评定》[32]中的相关规定，结合UPLCQ/Orbitrap HRMS测定白酒中EC含量[16]的不确定度分析，以期为实验室开发新检测方法、CNAS认证、质量控制提供科学、准确的理论依据，同时为测量白酒中其他有毒有害物质的不确定度分析提供参考，进而确保实验室检测结果的权威性与公正性，更好地保障白酒的食品安全与质量品质。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

酒样 贵州茅台酒厂（集团）习酒有限责任公司酱香成品酒；氨基甲酸乙酯标准品（纯度99.4%） 德国Dr.Ehrenstorfer公司；甲醇、甲酸 色谱纯，美国Fisher公司。

Q Exactive Focus 液质联用仪（配有电喷雾离子源（HESI）及Thermo Xcalibur 2.2数据处理系统）美国Thermo Fisher公司；UltiMate 3000超高效液相色谱仪 美国Thermo Dionex公司；AR2140电子天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；艾科浦超纯水机 美国Aquaplore公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品前处理 参考熊晓通等[16]的试验方法，略作改进，准确吸取1 mL酒样于10 mL刻度试管中，在85 ℃烘箱中烘至0.2～0.4 mL后取出，冷却至室温后加超纯水定容至1 mL，涡旋混匀，0.22 μm水相滤膜过滤后，待上机检测。

1.2.2 超高效液相色谱-高分辨质谱分析 色谱柱：AccucoreaQ 液相色谱柱（150 mm×2.1 mm，2.6 μm）；进样量：10 μL；流速：0.3 mL/min；柱温：35 ℃；流动相：A为0.1%（v/v）甲酸水溶液，D为甲醇；梯度洗脱程序：0～1 min，维持 5% D；1～4 min，5% D 线性变至95% D；4～5.5 min，维持 95% D；5.5～6 min，95% D线性变至5% D；6～10 min，线性变至5%D。

离子源：电喷雾离子化正离子模式；扫描类型：SIM模式；离子源温度：350 ℃；毛细管电压：2.3 kV；毛细管温度：200 ℃；S-lens RF level：80；鞘气流速：30 arb；辅助气流速：15 arb；AGC target：1×106；一级质谱全扫描分辨率：70000；C-trap最大注入时间：5 ms；扫描范围：55～95 m/z。

1.2.3 数学模型的建立 通过仪器可得标准溶液的峰面积，并经最小二乘法线性拟合可得标准曲线，待测EC质量浓度由标准曲线计算可知。影响各不确定度来源之间的相关因素采取多元回归分析，确定多个变量的因果关系，以建立预测的数学模型[20]。

白酒中EC含量计算公式见式（1）：

式中：X—表示试样中EC的含量，μg/L；C—表示标准工作曲线中得到的EC的质量浓度，ng/mL；V1—表示试样溶液最终定容体积，mL；V0—表示试样溶液所代表试样的取样体积，mL。

1.3 数据处理

通过仪器Thermo Xcalibur 2.2数据处理系统进行数据分析，并结合Excel软件拟合实验标准曲线。

2 结果与分析

2.1 不确定度来源分析

依据建立的数学模型，并对白酒中EC的测定结果有影响的各不确定度分量进行全面分析和量化，如，样品处理过程（包括样品量取、最终定容）、标准工作系列溶液配制（包括标准物质的纯度、标准溶液的配制以及标准曲线的拟合）、重复性实验、精密度、准确度等，并考虑了测定仪器以及实验温度变化引起的不确定度，具体引入的不确定因素如图1所示。

图1 白酒中EC测定不确定度因素来源分析Fig.1 Analysis of source of uncertainty factors in EC of the Chinese baijiu

2.2 不确定度的评定

2.2.1 样品前处理及上机引起的不确定度u（C1）

2.2.1.1 量取样品产生的不确定度u（V0） 用1000 μL移液器准确吸取 1 mL酒样（V0），参考 JJG 646-2006《移液器检定规程》[33]的要求，按B类评定，其1000 μL移液器的容量允差为±1.0%，假设按均匀分布，其不确定度是：若测量重复性为0.5%，其不确定度是：0.00289；若温度允差为±5 ℃，则温度变化引起的不确定度是：量取样品产生的不确定度和相对不确定度分别为

2.2.1.2 样品前处理后定容引入的不确定度u（V1） 样品经过部分挥发后用超纯水定容至V1为1 mL，按B类评定，其10 mL刻度试管的容量允差为±0.008 mL，假设按均匀分布，其不确定度是：=0.00462；若温度波动范围为±5 ℃，则

2.2.1.3 仪器自动进样引入的不确定度（仪器进样针容积）u（V2） 参考文献 [21,23]，UPLC-Q/Orbitrap HRMS自动进样器配置的进样针容积的相对标准偏差为±1%，假设按矩形分布，则0.0058。

综上所得，合成样品前处理及仪器自动上机引起的相对不确定为：

2.2.2 EC质量浓度引入的不确定度u（C2）

2.2.2.1 配制EC储备液产生的不确定度u（C2-1）参考文献[21,23]，准确称取标准品EC（m）8.0 mg（纯度99.4%），超纯水溶解后移至100 mL容量瓶并定容（80 mg/L）。根据EC标准证书得纯度（p）误差是±0.7%，假设按均匀分布，则根据AR2140电子天平检定证书，其最大允许误差为±0.1 mg，假设按均匀分布，则由玻璃量器的相关规定可知[34]，在（20±5）℃ 温度范围下 100 mL A 级容量瓶容量允差为±0.1 mL，假设为矩形分布，则定容体积引入的不确定度：溶剂的体积膨胀系数为2.1×10-4℃-1，假设按均匀分布，则由温度变化引起的不确定度为：故合成100 mL容量瓶定容体积引入的相对不确定度为：因此，其配制过程产生的相对不确定度为：

2.2.2.2 稀释储备液产生的不确定度u（C2-2） 用1 mL分度吸量管移取1 mL EC储备液于100 mL容量瓶中，加超纯水定容至刻度可得质量浓度为1 mg/L的标准溶液，并依次稀释可得质量浓度为0.1 mg/L的标准溶液。按B类评定，假设按均匀分布，结合相关标准的规定[34-35]，其计算结果见表1。

表1 稀释过程引入的不确定Table 1 Uncertainty arising by the dilution process

则稀释过程产生的相对不确定度为：

2.2.2.3 配制标准系列溶液产生的不确定度u（C2-3）用1 mL和2 mL分度吸量管移取0.2、0.5、1和2 mL标准溶液（0.1和1 mg/L）于10 mL容量管中并定容，可配得标准系列溶液为5、10、20、50、100、200 μg/L。根据玻璃量器的检定要求[35]，按B类评定，如表2所示。则其引入的相对不确定度为：

表2 配制过程引入的不确定度Table 2 Uncertainty arising by the configuration process

2.2.2.4 标准曲线拟合引入的不确定度u（C2-4） 参考文献[20-21,25,28]，将配制的6种不同质量浓度的标准系列溶液过0.22 μm水相微孔滤膜后直接上机检测，各取10 μL分别重复进样3次，采用最小二乘法拟合标准工作溶液的质量浓度（Ci）与峰面积（Ri）间标准曲线，如表3所示。取一阳性酒样，重复测定8次，结果见表4，则拟合标准曲线产生的不确定度按式（2）～式（7）计算：

表3 拟合标准曲线Table 3 Fitting standard curves

表4 阳性酒样测定数据Table 4 Datas of determination of positive Chinese baijiu

式中：B1为斜率；B0为截距；Ri表示第i次测定标准溶液中EC的峰面积；Ci表示第i次测定标准溶液中EC的质量浓度；p为对阳性酒样的测定次数（p=8）；n为6个标准系列溶液重复测定3次的总次数（n=18）；C0为阳性酒样中EC的平均值；为 标准溶液中EC的平均质量浓度，计算结果见表5。

表5 拟合标准曲线引入的不确定度分量Table 5 Results of uncertainty arising by standard curves fitting

则由EC质量浓度产生的相对不确定度为：

2.2.3 重复性实验引起的不确定度u（C3） 参考文献[20,21,23]，取一已知质量浓度的阳性基质样品，添加水平为50 μg/L的标准溶液，按前处理方法测定，重复测定10次，考察其重复性和回收率产生的相对不确定度。

参考文献[27-29]，取一已知质量浓度的阳性基质样品，添加水平为50 μg/L的标准溶液，按前处理方法测定，通过3位分析人员分别测定待测物的质量浓度，每人重复测定3次；同样，取一已知质量浓度的阳性基质样品，添加水平为50 μg/L的标准溶液，按前处理方法测定待测物的质量浓度，每天重复测定3次，重复测定6 d，考察其精密度和准确度产生的相对不确定度。

2.2.3.1 测量重复性产生的不确定度u（C3-1） 通过测定重复性试验，代入公式计算可得，如表6所示。

2.2.3.2 加标回收率R产生的不确定度u（C3-2） 测定加标回收率R如表6所示，按A类评定，其回收率引入的不确定度和相对不确定度由平均回收率、标准偏差 S (R)的结果分别代入公式可得。

表6 重复性试验测定结果Table 6 Results of determination of repeatability tests

2.2.3.3 测量精密度产生的不确定度u（C3-3） 由式（8）～式（12）计算可得精密度产生的不确定度和相对不确定度如表7和表8所示。

表7 不同天数测定结果Table 7 Results of determination by different days

式中：S (φ1)表示同一测试人员不同天数测定所得结果的标准偏差；n1为同一测试人员不同天数测定次数（n1=6×3=18）； φ¯1表示同一测试人员不同天数测定所得结果的平均值；S (φ2)表示不同测试人员同一天测定所得结果的标准偏差；n2为不同测试人员同一天测定（n2=3×3=9）；φ ¯2表示不同测试人员同一天测定所得结果的平均值。

则由精密度产生的相对不确定度为：urel（C3-3）=0.0338。

2.2.3.4 测量准确度产生的不确定度u（C3-4） 由式（13）～式（17）计算可得准确度产生的不确定度和相对不确定度如表7和表8所示。

表8 不同测试人员测定结果Table 8 Results of determination by different analysts

式中：S (η1)表示同一测试人员不同天数测定所得结果回收率的标准偏差；η¯1表示同一测试人员不同天数测定所得结果回收率的平均值；S (η2)表示不同测试人员同一天测定所得结果回收率的标准偏差；η¯2表示不同测试人员同一天测定所得结果回收率的平均值。

则准确度产生的相对不确定度：urel（C3-4）=0.0339。

综上所得，由测量重复性、回收率、精密度以及准确度引起的合成不确定度经计算为：urel(C3)=

2.3 合成不确定度

若不考虑各不确定度的相关性，则结合UPLCQ/Orbitrap HRMS测定白酒中EC含量的合成不确定度由公式计算。

2.4 扩展不确定度及结果表示

通过CNAS-GL006:2019《化学分析中不确定度的评估指南》[30]和JJF 1135-2005《化学分析测量不确定度评定》[32]的相关要求，在95%置信区间下，对于大量检测分析均选用包含因子k=2来衡量，则由公式计算UPLC-Q/Orbitrap HRMS测定白酒中EC含量的扩展不确定度。因此，其不确定度分析评估结果见表9。

表9 UPLC-Q/Orbitrap HRMS测定白酒中EC含量的不确定度评估结果Table 9 Uncertainty evaluation for the determination of EC in Chinese Baijiu by UPLC-Q/Orbitrap HRMS

3 结论

通过UPLC-Q/Orbitrap HRMS测定白酒中EC含量的不确定度评估过程可知，整个试验操作过程均可或高或低的引入不确定度。本研究全面地对标准溶液配制及标准曲线拟合、实验前处理过程、重复性试验等因素进行综合考虑，分析结果可知，最主要的不确定度来源从高到低依次为试验准确度、精密度、标准曲线拟合以及标准溶液配制，而试验重复性、回收率、样品量取及体积定容引入的不确定度相对较低。故在后续试验操作过程中，可考虑减少人员的操作及尽量减少间隔长时间测定，同时，采取增加标准曲线工作溶液，保持所用仪器良好的稳定性能，并对标准溶液和使用仪器定期开展校准或检定活动，同时，不断加强实验员的操作技能等途径，以达到降低实验过程中的不确定度，从而实现新开发方法可用性和检测结果可信度的实验要求。