高效液相色谱-串联质谱法测定化妆品中9种二苯甲酮类紫外吸收剂的含量

鲁素雅,邢海艳,刘 洋,吴义春,金 鹏,陈长毅

(淮安市食品药品检验所,淮安 223005)

在化妆品中,防晒类产品因具有保护人体免受紫外线辐射损伤的功能而受广大消费者的青睐,其中有效成分是防晒剂[1-4]。防晒剂按防晒机制可分为物理防晒剂和化学防晒剂两大类。物理防晒剂是指能反射或散射紫外辐射的化合物,化学防晒剂是指能吸收有害紫外辐射的有机化合物,通常又称紫外吸收剂[2]。紫外吸收剂对皮肤有保护作用,但过量使用也会影响皮肤健康,如过敏、泛红、光敏、发炎等[5]。

二苯甲酮类(BPs)防晒剂是芳香酮类化合物,由于其吸收波长广,吸收性好,被广泛添加于化妆品、纺织品中。同时二苯甲酮类化合物也是环境激素,会干扰人体内分泌,造成精子数量减少,并导致不孕症,因此国内外对化学防晒剂的使用种类和使用量都有明确的规定[6-9]。目前,《化妆品安全技术规范》(2015版)仅提供了二苯酮-2(BP-2)、二苯酮-3(BP-3)、二苯酮-4(BP-4)和二苯酮-5(BP-5)等4种二苯甲酮类化合物的检测方法,其中BP-5是BP-4的钠盐形式,在流动相中多以BP-4的形式存在,但仍有很多化合物并未收纳在现行有效的国家标准中,对于防晒剂的监管仍欠缺[10]。二苯甲酮类化合物的测定方法主要包括气相色谱法、液相色谱法、气相色谱-串联质谱法和液相色谱-串联质谱法等[10-17]。其中,液相色谱法和气相色谱法检测灵敏度低于质谱法,对于非准用化妆品防晒剂的检测优先考虑使用质谱法检测;气相色谱-质谱联用法主要适用于低沸点物质的检测,由于化妆品基质较复杂,故优先考虑使用专属性、通用性更高的液相色谱-质谱联用法检测二苯酮类化合物。

本工作建立了同时测定9种二苯甲酮类化合物的高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS),为二苯甲酮类化合物的监管与产品质量控制提供了更多的思路。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

AB QTRAP 4500 型高效液相色谱-串联质谱仪与AB QQQ 4000＋型高效液相色谱-串联质谱仪,均配有Turbo-V 离子源、蠕动泵和Analyst1.5.2数据处理系统;Waters Acquity型超高效液相色谱仪;U3000型高效液相色谱仪;XS205D 型电子天平;XP-6 型电子天平;Millipore 型超纯水机;KQ-250DV 型超声清洗仪。

混合标准溶液Ⅰ:1.0 mg·L－1,分别取各对照品适量,加乙腈溶解,稀释制成各组分质量浓度均为1.0 mg·L－1的混合标准溶液Ⅰ。使用时用乙腈稀释至所需质量浓度。

混合标准溶液Ⅱ:分别取各对照品适量,加乙腈溶解,稀释制成二苯酮-1(BP-1)、BP-3、二苯酮-6(BP-6)、二苯酮-8(BP-8)的质量浓度均为0.3 mg·L－1,二苯酮-10(BP-10)、二苯酮-12(BP-12)的质量浓度 均为0.15 mg·L－1,BP-2的质量浓度为0.4mg·L－1,BP-4的质量浓度为6 mg·L－1,二苯酮-7(BP-7)的质量浓度为2 mg·L－1的混合标准溶液Ⅱ。

BP-1(纯度100%,规格500 mg)、BP-2(纯度99.5%,规 格250 mg)、BP-3(纯 度99.8%,规 格100 mg)、BP-4(纯度94.7%,规格100 mg)、BP-6(纯度100%,规格100 mg)、BP-7(纯度100%,规格100 mg)、BP-8(纯度100%,规格100 mg)、BP-10(纯度100%,规格50 mg)、BP-12(纯度100%,规格250 mg);乙腈、四氢呋喃为色谱纯;高氯酸为优级纯;试验用水为一级水。

1.2 仪器工作条件

1)色谱条件 Waters ACQUITY UPLC®BEH C18色谱柱(100 mm×2.1 mm,1.7μm);柱温30 ℃;流量0.3 mL·min－1;进样量2μL;流动相A为0.1%(体积分数)甲酸溶液,B 为乙腈;梯度洗脱程序:0～4.0 min时,A 为40%;4.0～4.5 min时,A由40%降至5%,保持5.5 min;10.0～10.1 min时,A 由5%跳转至40%,保持1.9 min。

2)质谱条件 电喷雾离子(ESI)源;正离子扫描模式;多反应监测扫描模式;碰撞气压力68.95kPa,气帘气压力206.85kPa,雾化气压力379.225 k Pa,辅助气压力379.225 k Pa;毛细管电压4500 V;雾化温度500 ℃。监测离子对及相关参数设定见表1。

表1 质谱参数Tab.1 MS Parameters

1.3 试验方法

称取样品0.1 g置于50 mL 具塞试管中,加乙腈30 mL,超声提取30 min,冷却至室温,稀释至50 mL,静置,过滤,取续滤液用于HPLC-MS/MS分析。

2 结果与讨论

2.1 样品前处理中提取剂的选择

参考《化妆品安全技术规范》(2015年版)“5.1”“5.2”中防晒剂检测的提取溶剂[10],试验选取乙腈、四氢呋喃、体积比250∶450∶300∶0.2的甲醇-四氢呋喃-水-高氯酸混合溶剂等作为提取剂,比较了使用3种不同提取剂时各组分的回收率,结果见表2。

表2 使用不同提取剂时各组分的回收率Tab.2 Recovery of each component with different extractants %

由表2可知,以四氢呋喃和混合溶剂提取时,基质干扰严重,其中BP-4的回收率较低,BP-12的回收率偏高。从试剂配制简便性、试剂毒性大小、回收率结果等方面综合考虑,试验选择的提取剂为乙腈。

2.2 取样量的影响

试验比较了在0.1,0.2,0.4 g等不同取样量条件下各组分的回收率,结果见表3。

表3 在不同取样量下各组分的回收率Tab.3 Recovery of each component with different sampling amounts %

由表3可知,不同取样量下各组分的回收率差异不明显。同时用IBM SPSS Statistics 22统计软件对检测结果进行组间配对样本t检验,检验结果P值均大于0.05,说明不同的取样量对样品各组分回收率的影响无统计学差异。从化妆品中防晒剂添加量角度考虑,多为常量检测,因此取样量设定为0.1 g,如遇不同样品时可适当调整取样量或稀释样品。

2.3 耐用性试验

在HPLC-MS/MS 分析时,试验分别采用Waters ACQUITY UPLC®BEH C18色谱柱(100 mm×2.1 mm,1.7μm)、费罗门Kinetex®C18色谱柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)、Waters ACQUITY UPLC®BEH C18色谱柱(50mm×2.1 mm,1.7μm)等不同的色谱柱,调整流动相比例,并分别使用AB QTRAP 4500型高效液相色谱-串联质谱仪与AB QQQ 4000＋型高效液相色谱-串联质谱仪等不同的仪器进样,记录色谱图。结果表明,采用不同色谱柱和不同仪器分析时,9种组分分离效果均较好,响应值较高,说明方法耐用性较好,对色谱柱、仪器等要求较低。在1.2节仪器工作条件下,所得色谱图见图1。

图1 各组分在HPLC-MS/MS分析时的色谱图Fig.1 Chromatogram of each component analyzed by HPLC-MS/MS

2.4 基质效应

试验选取防晒喷雾类、防晒霜类、隔离霜类、粉底液类等4种典型的空白基质样品,按照试验方法分别制备空白基质溶液。用空白基质溶液配制基质匹配的混合标准溶液系列,按仪器工作条件测定,并绘制工作曲线。将4种典型基质匹配的工作曲线的斜率(k1)与用乙腈配制的混合标准溶液系列制作的标准曲线的斜率(k2)进行比较,斜率的比值见表4。斜率比值越接近1,说明基质效应越小。

表4 基质效应结果Tab.4 Results of matrix effect

由表4可知,采用HPLC-MS/MS测定时,两种曲线的斜率比值为0.808～1.118,说明该方法的基质效应较小,可不予考虑。试验直接采用不含基质的混合标准溶液进行定量分析。

2.5 标准曲线、检出限和测定下限

分 别 取0.01,0.02,0.05,0.1,0.2,0.5,1,2,5 mL混合标准溶液Ⅰ置于10 mL 容量瓶中,用乙腈稀释,制成混合标准溶液系列。按仪器工作条件测定,以各组分的质量浓度为横坐标,其对应的响应值为纵坐标绘制标准曲线。各组分的线性范围、线性回归方程和相关系数见表5。

参考《中华人民共和国药典》(2015年版)四部中检出限与测定下限常用的基于响应值标准偏差和标准曲线斜率法,分别取0.1 g样品加入5μL 混合标准溶液Ⅱ,按试验方法处理后,取2μL进样,溶液连续进样11次,计算各组分响应值的标准偏差(s)。按3倍的标准偏差与标准曲线斜率(k)的比值计算检出限(3s/k),按10倍的标准偏差与标准曲线斜率的比值计算测定下限(10s/k),结果见表5。

表5 线性参数、检出限和测定下限Tab.5 Linearity parameters,detection limits and lower limits of determination

2.6 稳定性试验

取100μg·L－1混合标准溶液,按仪器工作条件连续进样6次,计算各组分测定值的相对标准偏差(RSD),以验证仪器的稳定性。结果表明,BP-1、BP-2、BP-3、BP-4、BP-6、BP-7、BP-8、BP-10、BP-12测定值的RSD依次为2.0%,1.9%,3.3%,3.0%,4.0%,2.8%,4.9%,1.8%,2.5%,RSD均小于5.0%,说明仪器性能稳定,检测方法可行。

取100μg·L－1混合标准溶液,室温放置0,2,4,6,8,12,24,36,48,72 h 后,按仪器工作条件进样,记录各组分的响应值,观察溶液的稳定性。结果表明,测定时各组分的响应值无明显变化,说明溶液在72 h内稳定性较好。

2.7 精密度和回收试验

按照试验方法对空白样品进行3个浓度水平的加标回收试验,每个浓度水平平行测定6次,计算回收率和测定值的RSD,结果见表6。

由表6可知,各组分的回收率为70.9%～116%,RSD 为1.8%～12%,说明该方法适用于9种二苯甲酮类化合物的测定。

表6 精密度和回收试验结果(n＝6)Tab.6 Results of tests for precision and recovery(n＝6)

2.8 样品分析

按试验方法对防晒霜类、粉底液类、隔离霜类、防晒喷雾类等4种不同基质的15批样品进行测定,其中2批检出BP-3,检出量分别为1.53%和4.67%,1批检出BP-10,检出量为0.00126%。典型样品的色谱图如图2所示,在15批样品检测过程中未发现有干扰目标物测定的杂质峰,采用HPLC-MS/MS测定时可减小假阳性、假阴性出现的概率。

图2 防晒霜类样品的色谱图Fig.2 Chromatogram of the sunscreen sample

本工作建立了HPLC-MS/MS同时测定化妆品中9种二苯甲酮类紫外吸收剂含量的方法,以乙腈为溶剂,超声提取溶解,以C18色谱柱分离目标物,采用ESI源,正离子多反应监测模式进行检测。该方法流动相配制简便,分析快速,基质干扰小,准确度高,分离效果好,可满足含此类防晒剂化妆品的分析要求。