高效液相色谱法测定防晒化妆品中22种化学防晒剂的含量

卓 婧,简育莹*,卢端萍,唐 雯

(1.福建省食品药品质量检验研究院,福州 350001;2.福建省产品质量检验研究院,福州 350015)

随着防晒概念不断普及,防晒化妆品得到人们的广泛使用。防晒剂是防晒类化妆品中的主要功效成分,可分为物理防晒剂和化学防晒剂,大部分防晒化妆品会同时添加物理防晒剂和化学防晒剂。物理防晒剂主要是氧化锌、二氧化钛等,安全性相对较高。化学防晒剂有苯基苯并咪唑磺酸(恩素利唑)、3-亚苄基樟脑、二苯酮-3、奥克立林等。防晒产品不是一次用量越多越好,过量使用、长期低剂量使用化学防晒剂存在着不同程度致癌、致畸风险[1-3]。因此,建立准确可靠的化学防晒剂含量测定方法是防晒化妆品质量安全监管的必备技术支撑。

目前,常用的化学防晒剂的测定方法有高效液相色谱法(HPLC)[4-8]、气相色谱法[9]、液相色谱-质谱法[10]、气相色谱-质谱法[11-12]等,其中HPLC为主要测定方法,适用性广、灵敏度高、重现性好,其提取溶剂和流动相主要采用甲醇(或乙腈)-四氢呋喃-高氯酸溶液。2019年国家药品监督管理局颁布的第40号公告[13]也明确规定了22种化学防晒剂的检验方法,并收载入《化妆品安全技术规范》(2015年版)中,该方法的提取溶剂和流动相中使用了一定比例的四氢呋喃和高氯酸。四氢呋喃、高氯酸毒性大,对设备材料具有一定腐蚀性[14],对实验人员及环境危害较大。鉴于以上方法的不足,本工作采用低毒的异丙醇代替四氢呋喃,低腐蚀性的磷酸代替高氯酸,建立了一种适用性好、灵敏度高、重现性好,对人员、仪器、环境更为友好的HPLC 测定22种化学防晒剂含量的方法,并应用该方法对市场上防晒化妆品中的化学防晒剂进行测定。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Waters e2695型高效液相色谱仪,配二极管阵列检测器;Milli-Q 型超纯水器;ELmasonic S150型超声波清洗器,XPR56型百万分之一分析天平。

混合溶剂Ⅰ:体积比为5∶9的含0.1%(体积分数,下同)磷酸的甲醇-异丙醇的混合液。

混合溶剂Ⅱ:体积比为5∶9∶2 的甲醇-异丙醇-0.02 mol·L－1乙酸铵溶液(磷酸调至pH 5.0)的混合液。

单标准储备溶液Ⅰ:根据1～20号化学防晒剂(见表1)色谱响应情况,称取各标准品适量,用混合溶剂Ⅰ溶解后定容至一组20 mL 棕色容量瓶中[其中苯基苯并咪唑磺酸(恩素利唑)用少量10%(质量分数)氢氧化钠溶液溶解后,再用混合溶剂Ⅰ定容;甲酚曲唑三硅氧烷、乙基己基三嗪酮、亚甲基双-苯并三唑基四甲基丁基酚和双-乙基己氧苯酚甲氧苯基三嗪的脂溶性较高,直接用四氢呋喃溶解并定容],配制成单标准储备溶液Ⅰ,其质量浓度见表1。

混合标准储备溶液Ⅰ:移取上述单标准储备溶液Ⅰ各1 mL 于同一25 mL 棕色容量瓶中,用甲醇稀释并定容,配制成混合标准储备溶液Ⅰ,其质量浓度见表1。

单标准储备溶液Ⅱ:称取对苯二亚甲基二樟脑磺酸、苯基二苯并咪唑四磺酸酯二钠适量,用混合溶剂Ⅱ溶解并定容于一组20 mL棕色容量瓶中,配制成单标准储备溶液Ⅱ,其质量浓度见表1。

混合标准储备溶液Ⅱ:移取上述单标准储备溶液Ⅱ各2 mL 于同一25 mL 棕色容量瓶中,用甲醇稀释并定容,配制成混合标准储备溶液Ⅱ,其质量浓度见表1。

表1 标准品相关信息以及单标准储备溶液和混合标准储备溶液的配制Tab.1 Related information of standards,and preparation of single standard reserve solution and mixed standard reserve solution

甲醇、异丙醇、四氢呋喃为色谱纯,其余试剂为分析纯;试验用水为超纯水。各标准品相关信息见表1。20批防晒产品来自监督抽检样品。

1.2 色谱条件

Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm);检测波长311,340 nm;柱温35℃;进样量10μL。

第Ⅰ组流动相A 为体积比4∶1的甲醇-异丙醇混合液,B为0.1%磷酸溶液;流量1.2 mL·min－1。梯度洗脱程序:0～7.0 min时,A 由20%升至60%;7.0～12.0min时,A由60%升至80%,保持8.0min;20.0～30.0 min时,A 由80%升至99%,保持4.0 min;34.0～34.1 min,A 由99%跳 转 至100%,保持15.9 min;50.0～50.1 min,A 由100%跳转至20%,保持7.9 min。

第Ⅱ组流动相A 为甲醇,B 为0.02 mol·L－1乙酸铵溶液(磷酸调至pH 5.0);流量1.0 mL·min－1;梯度洗脱程序:0～9.0 min时,A 由5%升至100%,保持6.0 min;15.0～20.0 min时,A 由100%降至5%,保持3.0 min。

1.3 试验方法

准确称取化妆品样品0.25 g,置于25 mL 纳氏比色管中,加入适量的混合溶剂(第Ⅰ组防晒剂使用混合溶剂Ⅰ,第Ⅱ组防晒剂使用混合溶剂Ⅱ,下同),涡旋60 s(若为蜡基质化妆品,则先加入1 mL 四氢呋喃,涡旋30 s),再加入混合溶剂至近刻度,超声30 min,取出,待冷却后定容。

精密移取上述溶液1 mL 于10 mL 容量瓶中,用甲醇稀释并定容,混匀,经0.45μm 滤膜过滤作为供试品溶液。

2 结果与讨论

2.1 色谱行为

按照试验方法对化学防晒剂的混合标准溶液Ⅰ、Ⅱ进行测定,色谱图见图1。

图1 混合标准溶液的色谱图Fig.1 Chromatograms of mixed standard solution

2.2 提取溶剂和第二步稀释溶剂的选择

2.2.1 第Ⅰ组化学防晒剂

《化妆品安全技术规范》(2015年版)方法中防晒剂样品的提取溶剂为体积比250∶450∶300∶0.25的甲醇-四氢呋喃-水-高氯酸混合液,根据溶剂极性相似的原理,试验中使用低毒性、低腐蚀性的异丙醇替代四氢呋喃,考察了体积比为3∶1、9∶5、5∶9的含0.1%磷酸的甲醇-异丙醇混合液和体积比为9∶5∶6、5∶9∶6的含0.1%磷酸的甲醇-异丙醇-水混合液对第Ⅰ组20种化学防晒剂提取效果的影响。结果显示,提取溶剂为体积比5∶9 的含0.1%磷酸的甲醇-异丙醇的混合液即混合溶剂Ⅰ时提取效果较稳定、回收率较高,测得含量与规范方法测得的结果基本一致。

试验进一步比较了在甲醇-异丙醇的混合液中分别加入体积分数均为0.1%的磷酸、甲酸、高氯酸等不同种类的酸溶液时对第Ⅰ组20种化学防晒剂提取效果的影响。结果发现,不同种类的酸对第Ⅰ组20种化学防晒剂的提取效果无明显差异,因此试验选用低刺激性的磷酸。

蜡基质化妆品油水分配系数较大,脂溶性高,在进行样品提取时,需先加入1 mL 四氢呋喃涡旋30 s助溶后,再加入混合溶剂涡旋、超声提取,便于蜡基质化妆品中化学防晒剂的充分提取。第二步稀释溶剂考察时,分别以混合溶剂Ⅰ、甲醇为稀释溶剂,结果发现,混合溶剂Ⅰ做第二步稀释溶剂时,苯基苯并咪唑磺酸(恩素利唑)色谱峰峰形受溶剂效应影响出现裂峰,而选择甲醇作为第二步稀释溶剂时,苯基苯并咪唑磺酸(恩素利唑)色谱峰峰形得以改善,无裂峰,对同组其余化学防晒剂响应也无影响。综上考虑,试验采用混合溶剂Ⅰ、甲醇分别作为第Ⅰ组20种化学防晒剂的提取溶剂和第二步稀释溶剂。

2.2.2 第Ⅱ组化学防晒剂

参考第Ⅰ组提取溶剂,结合对苯二亚甲基二樟脑磺酸、苯基二苯并咪唑四磺酸酯二钠防晒剂极性较大的特点,试验分别采用体积比为5∶9∶2、5∶9∶4、5∶9∶6、5∶9∶8、5∶9∶10的甲醇-异丙醇-0.02 mol·L－1乙酸铵溶液(磷酸调至pH 5.0)的混合液对样品进行第Ⅱ组化学防晒剂的加标提取。结果显示,加入不同比例的0.02 mol·L－1乙酸铵溶液(磷酸调至pH 5.0)对对苯二亚甲基二樟脑磺酸的提取影响不大,回收率均大于90.0%;随着0.02 mol·L－1乙酸铵溶液(磷酸调至pH 5.0)比例增加,苯基二苯并咪唑四磺酸酯二钠的回收率有所降 低,分 别 为96.7%,85.9%,85.2%,88.0%,80.9%。因此,试验选择体积比为5∶9∶2的甲醇-异丙醇-0.02 mol·L－1乙酸铵溶液(磷酸调至pH 5.0)的混合液即混合溶剂Ⅱ为提取溶剂。

同第Ⅰ组提取步骤,在蜡基质化妆品样品提取时,需先加入1 mL四氢呋喃涡旋30 s助溶后,再加入混合溶剂Ⅱ涡旋、超声提取;甲醇作为第二步稀释溶剂时,对苯二亚甲基二樟脑磺酸、苯基二苯并咪唑四磺酸酯二钠提取效果、色谱响应均较好。综上考虑,试验中分别采用混合溶剂Ⅱ、甲醇作为第Ⅱ组化学防晒剂的提取溶剂和第二步稀释溶剂。

2.3 色谱条件的选择

2.3.1 色谱柱

试验考察了Agilent ZORBAX SB-C18、Waters SYMMETRY C18、Shim-pack VP-ODS等3款色谱柱对22种化学防晒剂分离效果的影响。结果发现,第Ⅰ组化学防晒剂在Waters SYMMETRY C18与Shim-pack VP-ODS色谱柱上的分离效果不佳,其中樟脑苯扎铵甲基硫酸盐与二苯酮-4、4-甲基苄亚基樟脑与二乙氨羟苯甲酰基苯甲酸己酯无法实现分离,易同时出峰;使用Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱时,第Ⅰ组20种化学防晒剂色谱峰的峰形好,出峰时间分布合理,且基线平稳,不影响成分定性定量,第Ⅱ组化学防晒剂同样具有良好的分离效果,响应值高。综合考虑,试验选择Agilent ZORBAX SB-C18作为色谱柱。

2.3.2 第Ⅰ组防晒剂的流动相

在HPLC分析测定防晒剂成分时,多使用甲醇(或乙腈)-四氢呋喃-高氯酸-水混合液作为流动相体系,该流动相体系易对设备材料造成腐蚀,影响使用寿命。试验采用异丙醇、磷酸替代四氢呋喃、高氯酸,考察了以甲醇-异丙醇(体积比3∶1、4∶1、5∶1)与0.1%磷酸溶液的混合液为流动相时对第Ⅰ组20种化学防晒剂分离效果的影响。结果显示:甲醇-异丙醇(体积比3∶1)与0.1%磷酸溶液的混合液进行梯度洗脱时,二甲基PABA 乙基己酯与丁基甲氧基二苯甲酰基甲烷、甲酚曲唑三硅氧烷与乙基己基三嗪酮不易分开;甲醇-异丙醇溶液(体积比5∶1)-0.1%磷酸溶液的混合液进行梯度洗脱时,双-乙基己氧苯酚甲氧苯基三嗪出峰时间较晚,峰形不好;甲醇-异丙醇溶液(体积比4∶1)-0.1%磷酸溶液的混合液作为流动相梯度洗脱时,第Ⅰ组20种化学防晒剂在58 min内获得良好分离。

另考察了0.1%磷酸溶液与0.1%(体积分数)甲酸溶液对第Ⅰ组20种化学防晒剂分离效果的影响,结果发现两种酸均可实现良好分离效果。试验最终选择体积比4∶1的甲醇-异丙醇溶液与0.1%磷酸溶液的混合液作为第Ⅰ组流动相。

2.3.3 分组优化

《化妆品安全技术规范》(2015 年版)方法中对苯二亚甲基二樟脑磺酸在第Ⅰ组进行分离测定时,在其出峰位置附近基线易出现大幅度波动,影响该成分定量的准确性。试验将对苯二亚甲基二樟脑磺酸放在第Ⅱ组中与苯基二苯并咪唑四磺酸酯二钠同时分析,色谱峰附近基线平稳,利于准确定量。

2.3.4 检测波长

试验采用双波长检测,在对22种化学防晒剂进行190～400 nm 波段紫外光谱扫描分析时,发现大部分化学防晒剂在311 nm 附近有最大紫外吸收,而对苯二亚甲基二樟脑磺酸在340 nm 附近有最大紫外吸收,其响应值是311 nm 处的2倍多。为了提高检测灵敏度,试验选择对苯二亚甲基二樟脑磺酸的检测波长为340 nm,其余21种化学防晒剂的检测波长为311 nm,见图1。

2.4 标准曲线、检出限和测定下限

取混合标准储备溶液Ⅰ、Ⅱ用甲醇稀释,配制成混合标准溶液系列,按试验方法进行测定。以22种化学防晒剂的质量浓度为横坐标,对应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。结果显示:22种防晒剂的质量浓度在一定范围内与对应的色谱峰面积呈线性关系,相关系数不小于0.9995,其线性参数见表2。

以阴性防晒类样品为基质,分别加入适量混合标准储备溶液Ⅰ、Ⅱ,按试验方法制备供试品溶液,以3倍信噪比(S/N)计算检出限(3S/N),以10倍信噪比计算测定下限(10S/N),结果见表2。22种化学防晒剂的检出限和测定下限满足测定要求。

表2 线性参数、检出限和测定下限Tab.2 Linearity parameters,detection limits and lower limits of determination

2.5 重复性试验

选择乳霜基和蜡基质2种不同基质阴性样品,分别按试验方法进行加标(见表3,各化学防晒剂低浓度水平的加标量),每个基质配制6份,计算测定值的相对标准偏差(RSD)。结果表明,各防晒剂测定值的RSD 均小于3.5%,说明方法重复性良好。

2.6 稳定性试验

制备混合标准溶液Ⅰ和Ⅱ,分别放置0,4,8,12,18,24 h后进样,记录各化学防晒剂的峰面积。结果显示,该体系中各化学防晒剂峰面积的RSD 为0.89%～2.3%,表明混合标准溶液在24 h内基本稳定。

2.7 精密度和回收试验

选择乳霜基和蜡基质2种不同基质阴性样品,添加低、中、高等3个不同浓度水平的标准溶液,按试验方法制备供试品溶液并测定,计算回收率及测定值的RSD,结果见表3。

由表3 可知,2 种基质中各组分的回收率为86.9%～113%,测定值的RSD 为0.10%～5.6%,表明该法具有良好的准确度和精密度。

表3 精密度和回收试验结果(n＝9)Tab.3 Results of tests for precision and recovery(n＝9)

表3 (续)

2.8 样品分析

按试验方法对20批防晒化妆品进行测定,并将测得的防晒剂含量与《化妆品安全技术规范》(2015年版)中方法测得的结果进行比较,结果见表4。

表4 样品测定结果比较Tab.4 Comparison of determination results of samples %

表4 (续)%

结果显示,20批样品共检出14种化学防晒剂,两种方法测定结果基本一致。

化学防晒剂的分析检测方法中提取溶剂和流动相多采用含有一定比例的四氢呋喃和高氯酸体系,毒性大,易挥发,腐蚀性强,对设备和配件要求较高,长期使用易缩短设备使用寿命。本工作建立了一种低毒性、低腐蚀性,对仪器、人员、环境友好的HPLC测定22种化学防晒剂含量的分析方法,用异丙醇、磷酸代替了四氢呋喃和高氯酸,优化样品提取溶剂和流动相,采用双波长检测分析,灵敏度高,重现性好,可操作性强,可为化学防晒剂的检测分析提供参考。