扶正抗癌方通过M2型巨噬细胞来源的外泌体途径抑制95D细胞转移的作用机制研究

李龙妹，廖桂雅，吴万垠

扶正抗癌方通过M2型巨噬细胞来源的外泌体途径抑制95D细胞转移的作用机制研究

李龙妹，廖桂雅，吴万垠

广州中医药大学第二附属医院，广东省中医院，广东 广州 510370

观察经扶正抗癌方预处理的M2型巨噬细胞来源的外泌体对95D细胞侵袭和迁移的影响，探讨其经外泌体途径抑制95D细胞转移的分子机制。利用佛波酯诱导人外周血单核细胞THP-1为巨噬细胞（Mφ组），利用重组人白细胞介素（IL）-4、重组人IL-13诱导THP-1细胞极化为M2型巨噬细胞（Mφ＋IL-4＋IL-13组），Western blot检测巨噬细胞标志物CD206、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）和转化生长因子-β（TGF-β）表达；差速离心法提取外泌体，透射电镜观察外泌体形态，Western blot检测外泌体标志物溶酶体相关膜蛋白-3（CD63）和肿瘤易感基因101（TSG101）蛋白表达；设置M2型巨噬细胞外泌体组（M2-exo组）和经扶正抗癌方（1.5 mg/mL）预处理24 h的M2型巨噬细胞外泌体组（FZKA-M2-exo组），Transwell实验和划痕实验分别检测95D细胞侵袭和迁移能力，RT-qPCR和Western blot分别检测E盒结合锌指蛋白（ZEB1）、E-钙黏素（E-cadherin）、N-钙黏素（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）mRNA和蛋白表达。与Mφ组比较，Mφ＋IL-4＋IL-13组CD206和TGF-β表达均显著升高（＜0.05，＜0.01），iNOS表达显著降低（＜0.01）。提取外泌体后，透射电镜观察可见膜性微囊泡结构物，且外泌体标志物CD63和TSG101蛋白表达均升高。与M2-exo组比较，FZKA-M2-exo组穿过Transwell小室细胞数量显著减少，光密度显著降低（＜0.01），划痕24 h后，划痕宽度明显增加（＜0.01），ZEB1、N-cadherin和Vimentin mRNA和蛋白表达显著降低（＜0.01），E-cadherin mRNA和蛋白表达显著升高（＜0.01）。扶正抗癌方可通过M2型巨噬细胞来源的外泌体途径抑制细胞上皮-间质转化进程，进而抑制95D细胞转移。

扶正抗癌方；细胞转移；巨噬细胞；外泌体；上皮-间质转化

前期临床研究表明，扶正抗癌方联合吉非替尼可延长表皮生长因子受体突变晚期非小细胞肺癌（NSCLC）患者无进展生存时间，对吉非替尼具有增敏、减毒作用[1-2]。同时发现，扶正抗癌方联合吉非替尼能通过激活多条通路抑制NSCLC细胞增殖、促进凋亡、逆转耐药等[3-8]。近年研究表明，肿瘤细胞与肿瘤微环境之间存在“交叉对话”[9]。肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）是肿瘤微环境的重要组成部分，而通过外泌体途径交换信息是肿瘤细胞与TAMs“对话”的重要途径。因此，本研究以高转移肺癌细胞95D为研究对象，通过诱导人外周血单核细胞THP-1为M2型巨噬细胞，提取其外泌体作用于95D细胞，观察扶正抗癌方通过巨噬细胞来源的外泌体途径对95D细胞侵袭和迁移的影响，并进一步探讨其作用机制。

1 实验材料

1.1 细胞株

人外周血单核细胞THP-1，中科院上海细胞库；高转移肺癌细胞95D，上海吉凯基因生物科技有限公司。

1.2 药物

扶正抗癌方（太子参15 g，白术15 g，黄芪30 g，麸炒薏苡仁30 g，甘草10 g，山慈菇30 g，白花蛇舌草30 g，龙葵30 g，石见穿30 g，八月札30 g，蛇泡簕30 g，莪术15 g），饮片由广东一方制药公司提供。具体制备过程参照文献[7]：加水浸泡煎煮，分离煎液，药渣继续加水煎煮，合并煎液，低温减压浓缩，喷雾干燥，制成颗粒，相当于含10.33 g原药材/g颗粒。

1.3 主要试剂与仪器

佛波酯（货号S1819-1mg）、结晶紫染色液（货号C0121），上海碧云天生物技术有限公司；重组人白细胞介素（IL）-4（货号041814-1）、重组人IL-13（货号101723），美国Peprotech公司；RPMI-1640培养基（货号8119305）、胎牛血清（货号10270-106）、胰蛋白酶（货号25200-072），美国Gibco公司；溶酶体相关膜蛋白3（CD63）抗体（货号ab68418）、肿瘤易感基因101（TSG101）抗体（货号ab125011），英国Abcam公司。5430R型冷冻离心机（德国Eppendorf公司），CP100WX超速冷冻离心机（日本HITACHI公司），Eon.C型多功能酶标仪（美国BioTek公司），ABI PrismTM7500荧光定量PCR仪（美国Thermo公司），化学发光成像系统（美国Bio-Rad公司），BX53显微镜（日本奥林巴斯公司）。

2 实验方法

2.1 扶正抗癌方药液制备

取扶正抗癌方颗粒，加入适量RPMI-1640培养基，37 ℃水浴使颗粒充分溶解，6 000 r/min离心5 min，取上清液，0.22 μm微孔滤膜过滤，4 ℃冰箱保存。

2.2 无外泌体血清制备

将普通胎牛血清4 ℃、100 000×离心90 min，去除沉淀后得到无外泌体胎牛血清。

2.3 细胞培养、诱导及鉴定

THP-1细胞用含10%无外泌体胎牛血清的RPMI-1640培养基置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养。向THP-1细胞培养基中加入100 ng/mL佛波酯培养48 h，将THP-1细胞诱导为巨噬细胞（Mφ组）；向THP-1细胞培养基中加入重组人IL-4（40 ng/mL）、重组人IL-13（20 ng/mL）培养48 h，将THP-1细胞诱导为M2型巨噬细胞（Mφ＋IL-4＋IL-13组），以M2型巨噬细胞标志物CD206和转化生长因子-β（TGF-β）表达升高、M1型巨噬细胞标志物诱导型一氧化氮合酶（iNOS）表达降低，提示M2型巨噬细胞诱导成功。

2.4 外泌体提取

采用差速离心法提取外泌体：4 ℃、2 000×离心20 min，去除死细胞；4 ℃、10 000×离心30 min，去除细胞碎片；4 ℃、100 000×离心70 min，沉淀加入适量PBS重悬，再以100 000×离心70 min，PBS重悬后0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，即得外泌体。

2.5 外泌体鉴定

透射电镜观察外泌体形态：将离心后的外泌体沉淀置于2%多聚甲醛中混悬均匀，取混悬液置于电镜铜网，干燥后加1%戊二醛固定2 h，0.4%醋酸双氧铀染色，透射电镜观察外泌体形态；Western blot检测外泌体标志物CD63和TSG101表达。

2.6 细胞侵袭和迁移能力检测

Transwell实验检测95D细胞侵袭能力：95D细胞用不含血清的RPMI-1640培养基培养12 h，收集细胞，设置M2型巨噬细胞外泌体组（M2-exo组）和经扶正抗癌方（1.5 mg/mL）预处理24 h的M2型巨噬细胞外泌体组（FZKA-M2-exo组），分别加入含M2-exo和FZKA-M2-exo的无血清培养基重悬，调整细胞密度为5×105个/mL，加入Transwell小室（提前包被基质胶），下室加入500 μL含20%无外泌体胎牛血清的RPMI-1640培养基培养12 h；4%多聚甲醛固定小室背面细胞，结晶紫染色后风干，正置显微镜下观察；用33%醋酸200 μL洗脱结晶紫，将洗脱液移至96孔板，多功能酶标仪波长570 nm处测定光密度，反映穿过小室的细胞数目。

划痕实验检测95D细胞迁移能力：用记号笔在12孔板背面穿过每孔中点划横线（定位），每孔接种3×105个95D细胞；待细胞长至铺满底面后，吸弃旧培养基，用200 μL枪头垂直于横线、穿过中点划痕，PBS除去脱落细胞；分别加入M2-exo和FZKA-M2-exo，置于无血清培养基中培养0、8、24 h后于正置显微镜下观察并拍照；Image J软件测量划痕宽度，评价细胞迁移能力。

2.7 RT-qPCR检测E盒结合锌指蛋白、E-钙黏素、N-钙黏素和波形蛋白mRNA表达

将M2-exo和FZKA-M2-exo分别加入95D细胞培养基中培养24 h，收集细胞，Trizol法提取总RNA；将RNA反转录为cDNA，进行PCR反应。采用2-ΔΔCt法计算mRNA相对表达量。引物序列见表1。

表1 各基因PCR引物序列

基因名称引物序列（5’～3’）产物长度/bp ZEB1F：GCTGGCAAGACAACGTGAAAG159 R：GCCTCAGGATAAATGACGGC E-cadherinF：CAGGTCTCCTCATGGCTTTGC164 R：CTTCCGAAAAGAAGGCTGTCC N-cadherinF：AGCGCAGTCTTACCGAAGG165 R：TCGCTGCTTTCATACTGAACTTT VimentinF：CGTCCACACGACCTACAG217 R：GGGGGATGAGGAATAGAGGCT GAPDHF：AAGCCTGCCGGTGACTAAC258 R：GCGCCCAATACGACCAAATC

2.8 Western blot检测E盒结合锌指蛋白、E-钙黏素、N-钙黏素和波形蛋白表达

将M2-exo和FZKA-M2-exo分别加入95D细胞培养基中培养24 h，收集细胞，加入RIPA裂解液提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度；等量蛋白上样，电泳、转膜、封闭后，分别加入ZEB1、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和GAPDH一抗（均为1∶1 000），4 ℃孵育过夜；加入二抗（1∶5 000），摇床室温孵育1 h；滴加ECL发光液，凝胶成像系统成像，采用Image Lab软件对蛋白条带进行分析。

3 统计学方法

4 结果

4.1 M2型巨噬细胞的诱导

与Mφ组比较，Mφ＋IL-4＋IL-13组M2型巨噬细胞标志物CD206和TGF-β表达显著升高（＜0.05，＜0.01），M1型巨噬细胞标志物iNOS表达显著降低（＜0.01），表明M2型巨噬细胞诱导成功。见图1。

注：与Mφ组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

4.2 M2型巨噬细胞外泌体提取与鉴定

将外泌体置于透射电镜下观察，可见膜性微囊泡结构物（见图2）。与M2-exo组比较，FZKA-M2-exo组细胞外泌体标志物TSG101和CD63表达升高，见图3。

注：箭头所示为膜性微囊泡结构

图3 2组M2型巨噬细胞外泌体TSG101和CD63蛋白免疫印迹图

4.3 扶正抗癌方通过外泌体途径对95D细胞侵袭和迁移的影响

与M2-exo组比较，FZKA-M2-exo组穿过Tanswell小室细胞数量明显减少，光密度明显降低（＜0.01）；划痕24 h后，划痕宽度明显增加（＜0.01）。见图4～图6。

4.4 扶正抗癌方通过外泌体途径对95D细胞E盒结合锌指蛋白、E-钙黏素、N-钙黏素和波形蛋白mRNA表达的影响

与M2-exo组比较，FZKA-M2-exo组95D细胞ZEB1、N-cadherin和Vimentin mRNA表达显著降低（＜0.01），E-cadherin mRNA表达显著升高（＜0.01）。见图7。

4.5 扶正抗癌方通过外泌体途径对95D细胞E盒结合锌指蛋白、E-钙黏素、N-钙黏素和波形蛋白表达的影响

与M2-exo组比较，FZKA-M2-exo组95D细胞ZEB1、N-cadherin和Vimentin蛋白表达显著降低（＜0.01），E-cadherin蛋白表达显著升高（＜0.01）。见图8、图9。

图4 扶正抗癌方通过外泌体途径对95D细胞侵袭的影响

图5 扶正抗癌方通过外泌体途径对95D细胞迁移的影响

注：与M2-exo组比较，**P＜0.01

注：与M2-exo组比较，**P＜0.01

注：与M2-exo组比较，**P＜0.01

图9 2组95D细胞ZEB1、E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白免疫印迹图

5 讨论

扶正抗癌方为广东省名中医吴万垠主任运用辨证＋辨病结合的思想总结的经验方，辨证以太子参、黄芪、白术、甘草、麸炒薏苡仁、莪术健脾益气、化湿祛瘀，意在补益后天之本，扶正抗癌；辨病以山慈菇、白花蛇舌草、龙葵、石见穿、八月札、蛇泡簕清热解毒、祛瘀散结。全方扶正与祛邪结合，辨病与辨证结合，共奏扶正抗癌之功，对肺癌患者长期带瘤生存具有重要价值。本研究从肿瘤转移的基础研究入手，揭示扶正抗癌方抑制肿瘤转移的分子机制。

肿瘤转移受多因素影响，转移后的肿瘤细胞在远端组织形成继发瘤，使患者病情逐步恶化，是肿瘤难以治愈的主要原因。研究发现，肿瘤微环境在肿瘤转移过程中扮演重要角色。TAMs是肿瘤微环境的重要组成部分，是由外周血单核细胞或组织巨噬细胞循环至肿瘤部位分化而成，占肿瘤组织的50%以上[10]。TAMs在不同微环境下可极化为M1型或M2型。退行性肿瘤中，在干扰素-γ、细菌脂多糖等Th1型细胞因子调控下，TAMs倾向于极化为M1型，表面标志物CD86高表达，且可分泌iNOS、肿瘤坏死因子-α等促炎因子，抑制肿瘤细胞增殖并破坏肿瘤细胞血管内皮，具有抗肿瘤功能[11]。恶性肿瘤中，在IL-4、IL-13等Th2型细胞因子调控下，TAMs倾向于极化为M2型，表面标志物CD206高表达，且能分泌IL-10、TGF-β等抑炎因子，降解细胞外基质，促进血管生成，具有促肿瘤功能[9，12]。本研究利用IL-4和IL-13诱导THP-1细胞，发现CD206和TGF-β表达显著升高，iNOS表达显著降低，表明成功将THP-1细胞诱导为M2型巨噬细胞。

外泌体是机体内多种细胞在生理或病理情况下，由细胞内多囊泡体与细胞膜融合后释放到细胞外基质中的膜性微囊泡，直径约30～150 nm。外泌体膜含有热休克蛋白、4次跨膜蛋白（如CD63）等蛋白，其膜内包裹了microRNA、mRNA、DNA和蛋白质（如细胞骨架蛋白、代谢酶和参与多囊泡体形成的蛋白TSG101）等活性物质，是介导细胞间通讯的重要分子[13]。以上组成蛋白可作为标志物，用于判断外泌体的存在。本研究采用差速离心法从M2型巨噬细胞培养上清液中提取外泌体，透射电镜观察可见膜性微囊泡结构，同时检测发现外泌体标志物CD63和TSG101表达均升高，表明成功提取M2型巨噬细胞外泌体。

研究发现，肿瘤来源的外泌体可诱导TAMs向M2型极化，促进肿瘤转移[14]；绿茶提取物作用于乳腺癌细胞后释放的外泌体可抑制TAMs向M2型极化[15]；TAMs来源的外泌体可运输miR-223至乳腺癌细胞，促进乳腺癌细胞侵袭和转移[16]。本研究分别提取M2-exo和FZKA-M2-exo作用于95D细胞，Transwell实验和划痕实验发现，FZKA-M2-exo能抑制95D细胞侵袭和迁移，表明扶正抗癌方能通过外泌体途径抑制95D细胞转移。

上皮-间质转化（EMT）是指上皮细胞向间质细胞转化的过程，是影响肿瘤细胞转移的另一个重要因素。肿瘤细胞发生EMT后，更容易浸入邻近组织和血管，并通过血液循环系统转移至远端组织形成继发瘤[17]。EMT相关标志物可分为上皮细胞标志物和间充质细胞标志物，前者以E-cadherin为代表，后者以N-cadherin和Vimentin为代表。同时，EMT发生受多种转录因子调控，ZEB1和ZEB2是其中重要一类，其可与靶基因的E盒结合，通过抑制上皮连接与极性表型基因表达，促进间质表型基因表达，进而诱导EMT发生。本研究发现，FZKA-M2-exo可抑制ZEB1、N-cadherin、Vimentin mRNA和蛋白表达，促进E-cadherin mRNA和蛋白表达。

综上所述，扶正抗癌方可通过改变M2型巨噬细胞外泌体特性，抑制95D细胞EMT进程，从而抑制95D细胞转移。

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Study on Mechanism ofDecoction on Inhibiting 95D Cells Metastasis Through M2-type Macrophage-derived Exosomes

LI Longmei, LIAO Guiya, WU Wanyin

To observe the effects of M2-type macrophage-derived exosomes treated withDecoction on the invasion and migration of 95D cells; To discuss the molecular mechanism ofDecoction for inhibiting 95D cells metastasis through exosomes pathway.The phorbol ester was used to induce the peripheral blood mononuclear cells THP-1 into macrophages (Mφ group). Recombinant human interleukin (IL) -4 and recombinant human IL-13 were used to induce the polarization of THP-1 cells into M2-type macrophages (Mφ+IL-4+IL-13 group). The expression of macrophage marker CD206, inductible nitric oxide synthase (iNOS) and transforming growth factor-β (TGF-β) were detected by Western blot. Exosomes were extracted by differential centrifugation, the morphology of exosomes was observed under transmission electron microscope. The proteins expression of exosome markers lysosomal-associated membrane protein 3 (CD63) and tumor susceptibility gene 101 (TSG101) were detected by Western blot. M2-type macrophage-derived exosomes group (M2-exo group) and M2-type macrophage-derived exosomes treated withDecoction (1.5 mg/mL) group (FZKA-M2-exo group) were set up. The invasion and migration of 95D cells were detected by Transwell assay and scratch assay respectively. The mRNAs and proteins expression of Zincfinger ebox binding homeobox 1 (ZEB1), E-cadherin, N-cadherin and Vimentin were detected by RT-qPCR and Western blot, respectively.Compared with the Mφ group, the expression of CD206 and TGF-β in Mφ+IL-4+IL-13 group significantly increased (<0.05,<0.01), and the expression of iNOS significantly decreased (<0.01). Membranous microvesicle structures were observed in exosomes, and the expression of exosome marker CD63 and TSG101 increased. Compared with the M2-exo group, the number of cells passing through Transwell chamber in FZKA-M2-exo group was significantly reduced, and the optical density significantly decreased (<0.01), the scratch width after 24 h was significantly wider (<0.01), and the mRNAs and proteins expression of ZEB1, N-cadherin, and Vimentin significantly decreased (<0.01), while the mRNA and protein expression of E-cadherin significantly increased (<0.01).Decoction can inhibit the process of epithelial mesenchymal transition through the M2-type macrophage-derived exosomes pathway, and then inhibit the metastasis of 95D cells.

Decoction; cell metastasis; macrophage; exosome; epithelial mesenchymal transition

R285.5

A

1005-5304(2021)12-0050-06

10.19879/j.cnki.1005-5304.202104619

国家自然科学基金（81803919、81974543）；广东省自然科学基金博士启动项目（2018A030310601）

吴万垠，E-mail：wwanyin@126.com

（2021-04-30）

（修回日期：2021-05-19；编辑：郑宏）