大柴胡汤治疗肝细胞癌lncRNA-miRNA-mRNA转录网络整合分析

郑飘，陈博威，宁迪敏，肖唯，田雪飞

大柴胡汤治疗肝细胞癌lncRNA-miRNA-mRNA转录网络整合分析

郑飘1，陈博威2，宁迪敏1，肖唯3，田雪飞1

1.湖南中医药大学中西医结合学院，湖南 长沙 410208；2.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007；3.中南大学湘雅医院中西医结合研究所，湖南 长沙 410008

挖掘大柴胡汤治疗肝细胞癌的lncRNA-miRNA-mRNA调控网络，探讨其抗肝癌作用机制。利用中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）、GEO、miRDB、miRTarBase、TargetScan数据库获取大柴胡汤的活性成分、预测靶点及肝细胞癌的差异表达长链非编码RNA（lncRNAs）、微小RNA（miRNAs）和mRNAs，通过R语言和Perl软件筛选大柴胡汤治疗肝细胞癌的关键lncRNAs、miRNAs、mRNAs。采用Cytoscape3.7.0软件和STRING数据库构建活性成分-靶点网络、lncRNA-miRNA-mRNA转录网络和蛋白相互作用网络，进行GO和KEGG富集分析，并予分子对接验证，进行整合分析。得到大柴胡汤治疗肝细胞癌的97个有效成分和42个靶点，构建了由19个关键lncRNAs、23个关键miRNAs和42个关键mRNAs组成的lncRNA-miRNA-mRNA转录网络。富集分析结果显示，这些靶基因参与了肿瘤的生存、凋亡、自噬、氧化应激、蛋白激酶等生物学过程，主要通过PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路和TNF信号通路等发挥作用。大柴胡汤治疗肝细胞癌具有多成分、多靶点、多途径协同作用特点，可为相关研究提供依据和方向。

肝细胞癌；大柴胡汤；转录网络；生物信息学；网络药理学；分子对接

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是原发性肝癌最主要的组织学亚型，具有侵袭和转移率高、复发风险高、中晚期并发症严重等特点。目前，其临床首选方法为手术、放疗和化疗。尽管靶向药物的新发展为肝癌治疗带来希望，但价格昂贵、反应率低、耐药性频繁，导致其临床应用局限。大柴胡汤出自《伤寒论》，由柴胡、大黄、枳实、黄芩、半夏、白芍、大枣和生姜组成，有疏肝理气之功。临床研究表明，大柴胡汤对HCC表现出良好疗效，可增强HCC患者机体免疫力，减少并发症的发生发展[1-2]。实验研究显示，大柴胡汤可促进肝癌HepG2细胞凋亡、抑制肝纤维化和调节代谢等[3-5]。然而，以往研究主要集中于单一靶点和单一机制，未能基于中医整体观念系统探讨大柴胡汤治疗HCC的分子机制。

在HCC的病理及治疗研究中，由长链非编码RNA（lncRNA）、微小RNA（miRNA）和mRNA组成的转录网络逐渐受到关注，lncRNA在转录后水平上作为竞争性内源RNA，通过miRNA的特异性海绵吸附间接降低miRNA与下游靶基因的结合，从而实现基因调控[6]。研究发现，lncRNA和miRNA在HCC的发生和发展中起着至关重要的作用，其广泛参与免疫抑制、氧化应激、血管生成、增殖、转移和细胞代谢等生物过程，lncRNA、miRNA和mRNA的交联已成为与HCC进展相关的新兴课题[7-9]。中药及其有效成分对lncRNA、mRNA和miRNA表达的调控也逐渐成为研究热点，现已发现多种中药及有效成分在肿瘤转录调控中的作用，如柴胡有效成分柴胡皂苷D介导肿瘤细胞凋亡和多耐药逆转效应可能通过lncRNA的调控实现[10]，大黄活性成分大黄素甲醚通过调节miR-370诱导肝癌细胞凋亡[11]，黄芩有效成分黄芩素对肝癌HepG2细胞增殖和凋亡的作用与miR-34a密切相关[12]。基于以往研究，笔者利用生物信息学方法挖掘大柴胡汤治疗HCC的活性成分-靶点网络并构建lncRNA-miRNA-mRNA转录网络，以期阐明大柴胡汤多组分、多靶点、多途径协同作用的分子机制，并为后续基础和临床研究提供依据。

1 资料与方法

1.1 活性成分筛选和靶点预测

通过中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php）获取大柴胡汤组方药物柴胡、大黄、枳实、黄芩、半夏、白芍、大枣和生姜的有效成分。根据药物的药代动力学特征，以口服生物利用度（OB）≥30%和类药性（DL）≥0.18为条件进行活性成分筛选[13]，通过该数据库查询活性成分的潜在靶点，通过Perl（https://www.perl.org）将靶点导入UniProt数据库（http://www.uniprot.org），获得目标基因官方名称。

1.2 差异表达lncRNAs、miRNAs和mRNAs挖掘

HCC基因表达谱原始数据（GSE101728）来源于基因表达综合数据库GEO（https://www.ncbi.nlm.nih. gov/geo）。该数据的人体组织样本来自复旦大学中山医院，包含HCC患者的7对肿瘤组织和癌旁组织（基因芯片平台：GPL21047）。采用Perl和R4.0软件筛选差异表达的lncRNA，阈值为|log2（FC）|＞1.5和＜0.05[14]，进而通过Mircode数据库（http://www. mircode.org）筛选与lncRNA结合的miRNAs。将获得的miRNAs通过miRDB（http://mirdb.org）、miRTarBase（http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw）和TargetScan（http://www.targetscan.org）数据库进行映射，最终得出由miRNA调控的mRNAs。

1.3 活性成分-靶点和lncRNA-miRNA-mRNA相互作用网络构建

采用Perl将HCC差异表达基因与大柴胡汤潜在靶点取交集，获得可能参与大柴胡汤治疗HCC的活性成分和关键lncRNAs、miRNAs、mRNAs。采用Cytoscape3.7.0构建lncRNA-miRNA-mRNA的成分-靶点网络和三元转录网络并进行可视化。采用STRING数据库（https://string-db.org/）构建关键mRNAs蛋白相互作用（PPI）网络并进行可视化，设置物种为“homo sapiens”，最小相互作用得分为0.4。

1.4 靶点功能富集分析

使用R软件Biocmanager和ClusterProfiler对获得的关键靶点进行GO和KEGG富集分析。GO对基因产物可能的生物过程（BP）、细胞组分（CC）及分子功能（MF）进行描述，KEGG对基因组注释信息进行分类，从而得出最显著的生物学过程。

1.5 分子对接分析

从TCMSP获得大柴胡汤主要活性成分的三维结构作为配体，从RCSB PDB数据库（https://www.rcsb. org/）获得关键靶点的三维结构作为受体。使用AutodockTools1.5.6对受体和配体进行能量最小化，并转换为PDBQT格式，获得用于分子对接模拟的三维网格盒，使用AutoDock Vina 1.1.2进行分子对接，采用PyMOL（https://www.pymol.org/）进行可视化。

2 结果

2.1 大柴胡汤活性成分及靶点

通过TCMSP数据库获得大柴胡汤121个活性成分，其中柴胡12个、大黄7个、枳实18个、黄芩28个、半夏26个、白芍8个、大枣18个、生姜4个，去除重复成分后，共筛选出108个候选活性成分。主要活性成分信息见表1。共检索到1 438个靶点，合并重复项后，获得295个靶点。

表1 大柴胡汤主要活性成分信息

编号名称OB/%DL靶点数来源 编号名称OB/%DL靶点数来源 MOL000098quercetin（槲皮素）46.430.28141柴胡，大枣 MOL007879tetramethoxyluteolin（四甲氧基丁醇）43.680.3727枳实 MOL000422kaempferol（山柰酚）41.880.2456柴胡，白芍 MOL000173wogonin（汉黄芩素）30.680.2342黄芩 MOL000358beta-sitosterol（β-谷甾醇）36.910.7528大黄，大枣，半夏， MOL002714baicalein（黄芩素）33.520.2134黄芩 黄芩，生姜，白芍 MOL002928oroxylin a（木蝴蝶素）41.370.2323黄芩 MOL000449stigmasterol（豆甾醇）43.830.7627柴胡，大枣，半夏， MOL001689acacetin（金合欢素）34.970.2423黄芩 黄芩，生姜 MOL000675oleic acid（油酸）33.130.1445半夏 MOL000492(+)-catechin（(+)-儿茶素）54.830.249大枣，白芍 MOL002670cavidine（卡文定碱）35.640.8124半夏 MOL000096(-)-catechin（(-)-儿茶素）49.680.249大黄，大枣 MOL006594eciphin（卵磷脂）43.350.0323半夏 MOL002914eriodyctiol (flavanone)41.350.246黄芩，枳实 MOL006932l-Pseudoephedrine（左旋伪麻黄碱）45.010.0321半夏 （淫羊藿醇(黄烷酮)） MOL001924paeoniflorin（芍药苷）53.870.794白芍 MOL000359sitosterol（谷甾醇）36.910.753黄芩，白芍 MOL001919(3S,5R,8R,9R,10S,14S)-3,17-43.560.532白芍 MOL000354isorhamnetin（异鼠李素）49.600.3130柴胡 dihydroxy-4,4,8,10,14-pentamethyl- MOL004609areapillin（茵陈黄酮）48.960.4114柴胡 2,3,5,6,7,9-hexahydro-1H-cyclopenta MOL0045983,5,6,7-tetramethoxy-2-(3,4,5-31.970.5910柴胡 [a]phenanthrene-15,16-dione trimethoxyphenyl) chromone MOL001918paeoniflorgenone（芍药苷元）87.590.371白芍 （3,5,6,7-四甲氧基-2-(3,4,5- MOL000211mairin（丁子香萜）55.380.781白芍 三甲氧基苯基)色酮） MOL000627stepholidine（千金藤碱）33.110.5425大枣 MOL000490petunidin（矮牵牛花素）30.050.318柴胡 MOL007213nuciferin（核黄素）34.430.4024大枣 MOL000471aloe-emodin（芦荟大黄素）83.380.2422大黄 MOL012921stepharine（千金藤林碱）31.550.3324大枣 MOL002235eupatin（泽兰黄醇素）50.800.4114大黄 MOL002773beta-carotene（β-胡萝卜素）37.180.5821大枣 MOL002281toralactone（决明子内酯）46.460.247大黄 MOL0061296-methylgingediacetate248.730.323生姜 MOL002268rhein（大黄酸）47.070.286大黄 （6-甲基银杏二乙酸酯2） MOL000006luteolin（木犀草素）36.160.2554枳实 MOL001771poriferast-5-en-3beta-ol36.910.752生姜 MOL004328naringenin（柚皮素）59.290.2134枳实 （多孔甾醇-5-烯-3β-醇） MOL005828nobiletin（川陈皮素）61.670.5231枳实

2.2 肝细胞癌差异表达lncRNAs、miRNAs和mRNAs

通过GSE101728的基因芯片共获得HCC差异基因447个（见图1a），其中49个差异性lncRNAs（图1b），筛选出832个lncRNA-miRNA调控关系和1 920个miRNA-mRNA调控关系。

2.3 活性成分-靶点和lncRNA-miRNA-mRNA转录网络

将HCC差异表达基因与大柴胡汤潜在靶点取交集，获得97个有效活性成分、19个关键lncRNAs、23个关键miRNAs和42个关键mRNAs。大柴胡汤治疗HCC的活性成分-靶点网络见图2，其中活性成分槲皮素、木犀草素、汉黄芩素、川陈皮素和山柰酚的节点度较高（见表2）。lncRNA-miRNA-mRNA转录网络见图3，节点度较高的lncRNAs RUSC1-AS1、DIO3OS、LINC00487、FAM99A，miRNA miR-17-5p、miR-125b-5p、miR-24-3p和miR-107可能在网络中起关键作用。核心靶点PPI网络包括38个节点和284条边，在潜在靶基因中，MYC、MMP2和CCND1节点度相对较高，可能是核心作用基因（见图4）。

注：a.火山图；b. lncRNAs热图

注：蓝色为靶点基因；黄色为柴胡成分，橙色为大黄成分，青色为枳实成分，品红为黄芩成分，绿色为半夏成分，浅绿为白芍成分，红色为大枣成分，粉色为生姜成分，紫色为共有成分

表2 大柴胡汤治疗HCC前10位候选活性成分及节点度

编号名称节点度 MOL000098quercetin（槲皮素）26 MOL000006luteolin（木犀草素）13 MOL000173wogonin（汉黄芩素）10 MOL005828nobiletin（川陈皮素） 9 MOL000422kaempferol（山柰酚） 7 MOL000354isorhamnetin（异鼠李素） 7 MOL002773beta-carotene（β-胡萝卜素） 7 MOL0029335,7,4’-Trihydroxy-8-methoxyflavone（5,7,4’-三羟基-8-甲氧基黄酮） 7 MOL000675oleic acid（油酸） 6 MOL002714baicalein（黄芩素） 6

2.4 关键靶点GO和KEGG富集分析

通过GO和KEGG富集分析揭示关键靶点参与的生物过程和途径[15]。共获得679个GO富集结果，其中分子功能主要为激活转录因子结合、RNA聚合酶Ⅱ转录因子结合、转录因子活性等，生物过程主要为对氧水平的响应、对金属离子的响应、对体液水平的调节及成纤维细胞分化等，细胞组分主要为蛋白激酶复合物，丝氨酸、苏氨酸蛋白激酶复合物，转录因子复合物等。共获得107条KEGG通路富集结果，包括乙型肝炎、癌症microRNA、蛋白聚糖、PI3K-Akt（磷酸肌醇3激酶-蛋白激酶B）信号通路、MAPK（促分裂原激活蛋白激酶）信号通路、TNF（肿瘤坏死因子）信号通路等。见图5。

注：红色为lncRNA，绿色为miRNA，蓝色为mRNA

图5 大柴胡汤治疗HCC差异表达基因富集分析

2.5 分子对接分析

将大柴胡汤治疗HCC的活性成分槲皮素、木犀草素、汉黄芩素、川陈皮素和山柰酚分别与PIK3CA（PDB ID：4tuu）、AKT1（PDB ID：6ccy）和MYC（PDB ID：6g6k）进行分子对接。PIK3CA和AKT1是KEGG主要通路PI3K-Akt信号通路中的标记蛋白，MYC是PPI网络中节点度最高的靶点。当结合能＜-5 kcal/mol时，配体与受体可以实现较好的结合[16]。分子对接结果表明，各活性成分均能与PIK3CA、AKT1和MYC很好结合（见表3），其中木犀草素与3个靶点的亲和力较佳（见图6）。

表3 大柴胡汤前5位候选活性成分与主要蛋白分子对接结果

活性成分分子式结合能/（kcal/mol） PIK3CAAKT1MYC 槲皮素C15H10O7-7.2-7.8-5.5 木犀草素C15H10O6-7.8-7.9-6.0 汉黄芩素C16H12O5-7.5-7.6-5.4 川陈皮素C21H22O8-7.5-7.1-4.9 山柰酚C15H10O6-8.3-7.8-5.5

图6 木犀草素与核心靶点分子对接模式图

3 讨论

由于HCC确诊时通常已为晚期，且伴随复杂的并发症，针对性治疗选择有限，5年存活率仅为18%[17-18]。单一药物成分和治疗措施无法有效控制HCC的病理变化，中药多成分、多靶点的作用特征为该病的治疗提供了新思路[19]。中医认为，肿瘤病机以热毒瘀滞、气机不畅为主，而肝为气机调节的枢纽。因此，肝癌治疗主要采用清热、散结、疏通气机之法，大柴胡汤为代表性处方[20-21]。既往的基础研究及循证医学证据表明，大柴胡汤对肝癌具有良好疗效[6-7]。本研究从108种候选活性成分中筛选出大柴胡汤治疗HCC的主要活性成分。其中，槲皮素（MOL000098，OB＝46.43%，DL＝0.28）是大柴胡汤最重要的化合物之一，其通过调节AKT-mTOR、PI3K、MAPK等途径，以调节miRNA、增强金属离子锌活性、减少活性氧形成、下调丝氨酸-苏氨酸激酶，在HCC治疗中发挥抗氧化、抗增殖、促凋亡和抗糖酵解活性[22-26]。木犀草素（MOL000006，OB＝36.16%，DL＝0.25）通过调节PI3K、Akt信号通路在促进肝癌细胞凋亡中起重要作用，在HCC病理过程中可抑制炎症和肝脏纤维化[27-28]。汉黄芩素（MOL000173，OB＝30.68%，DL＝0.23）通过下调p-Akt、周期蛋白D（cyclin D）和基质金属蛋白酶2（MMP2）抑制HCC的增殖和侵袭[29]。川陈皮素（MOL005828，OB＝61.67%，DL＝0.52）在体内外对HCC均可发挥明显的抑制作用[30]。山柰酚（MOL000422，OB＝41.88%，DL＝0.24）可有效缓解HCC中的肝纤维化，降低缺氧条件下缺氧诱导因子-1（HIF-1）和MAPK活性，并抑制肝癌细胞的存活；它与木犀草素结合，通过活性氧介导的线粒体，靶向获得对HCC中肿瘤细胞的选择性杀伤能力[31-33]。以上研究均支持本研究网络预测结果，反映了大柴胡汤治疗HCC的“多成分”特征。

非编码RNA（ncRNA）通过调节蛋白质编码基因的转录以加速癌症的进展。作为典型的ncRNA，越来越多参与包括HCC在内的肿瘤发展过程的lncRNA和miRNA被评估鉴定出来[34]。本研究基于GEO数据库HCC表达谱筛选的差异表达基因构建了大柴胡汤治疗HCC的lncRNA-miRNA-mRNA转录网络。该网络中有42个潜在mRNAs，其中在PPI网络中节点度较高的关键靶点均与HCC相关，节点度最高的MYC（包括c-MYC、n-MYC和l-MYC）为重要的癌基因。不受控制的信号传导是肝癌的关键驱动力，MYC通过与ncRNA的复杂串扰参与HCC细胞周期过程、细胞凋亡、代谢、血管生成和转移[35-36]。MMP2、E2F1和CCND1（cyclin D1）主要参与肝癌的细胞周期、增殖和凋亡，VEGFA参与血管生成过程[37-38]。分子对接结果表明，MYC与大柴胡汤治疗HCC的主要活性成分结合良好。miRNA通过调节靶基因在HCC发生中起特定作用。在转录网络miRNA中节点度最高的miR-17-5p（属于miR-17-92簇）是HCC的关键标志物，可调控多个功能靶点。miR-17-5p通过c-MYC的调节回路，以及MMP2和MAPK的激活促进HCC的血管生成、增殖、侵袭和转移。在非转移性肝癌中，miR-17-5p与E2F1和c-MYC形成反馈回路，导致Caspase介导的细胞凋亡[39-41]。miR-24-3p和miR-125b-5p为乙型肝炎病毒（HBV）相关HCC的生物标志物，并且miR-107靶向MMP2以介导HCC侵袭[42-44]。lncRNA参与了HCC发生和发展的许多方面，其中RUSC1-AS1能通过miR-7-5p促进HCC细胞增殖并抑制细胞凋亡，DIO3OS通过竞争性结合miRNA调节HCC的恶性侵袭，LINC00487被确定为HCC患者纤维化的预测因子，FAM99A与HIF-1α相关联，以在缺氧诱导下介导HCC的转移[45-48]。因此，在此转录网络中，大柴胡汤可能通过RUSC1-AS1等lncRNAs，参与调控miR-17-5p等miRNAs对mRNA的MYC、E2F1反馈回路，进而参与HCC血管生成、增殖、侵袭和转移过程，发挥治疗作用。大柴胡汤治疗HCC的lncRNA-miRNA-mRNA转录网络在一定程度上反映了大柴胡汤治疗HCC的“多靶点”特征。

大柴胡汤治疗HCC的靶基因为转录网络中分子功能的实现者，进一步对其进行GO和KEGG富集分析，结果表明，肝癌中大柴胡汤调控的转录本与转录因子活性、对氧水平的响应、蛋白激酶复合物、成纤维细胞分化、PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路和TNF信号通路密切相关。该预测结果与以往研究一致，在细胞和分子水平上，HCC的发生和发展机制与氧化应激、通过miRNA的HBV和宿主的相互调节、纤维化微环境和蛋白激酶引起的信号转导异常密切相关[43]。PI3K-Akt信号通路是调节细胞生长、代谢和存活的经典途径，在HCC的1/3～1/2中被激活，并且与肿瘤级别、血管浸润、肝内转移、细胞凋亡和基质金属蛋白酶的上调密切相关。MAPK途径激活转录因子基因c-MYC、c-FOS和c-JUN，以驱动HCC的生长和分化。TNF通过细胞因子激活生长信号以影响HCC的侵袭，TNF-α信号通路、MAPK信号通路则促进HCC的增殖和转移[49-51]。分子对接结果显示，大柴胡汤治疗HCC的主要活性成分可与PI3K-Akt信号通路中的相关蛋白很好地结合，从而进一步证明了预测的准确性。大柴胡汤对HCC的治疗与多种信号通路和多种生物学过程有一定联系，反映了大柴胡汤治疗HCC的“多途径”特征。

本研究通过整合分析探索了大柴胡汤治疗HCC的机制，提示大柴胡汤的多种活性成分在HCC治疗中具有协同作用，并且涉及对lncRNA-miRNA-mRNA网络串扰的调节。转录调控网络中的靶基因主要与肿瘤的存活、凋亡、自噬、氧化应激、蛋白激酶等密切相关，并可能通过PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路和TNF信号通路发挥作用，影响HCC的增殖和存活。本研究结果反映了大柴胡汤治疗疾病多成分、多靶点、多途径的特点，可为大柴胡汤治疗HCC提供理论依据，并为进一步临床和实验研究提供方向。

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Integration Analysis of lncRNA-miRNA-mRNA Transcriptional Network in the Treatment of Hepatocellular Carcinoma withDecoction

ZHENG Piao1, CHEN Bowei2, NING Dimin1, XIAO Wei3, TIAN Xuefei1

To characterize the lncRNA-miRNA-mRNA regulatory network ofDecoction in the treatment of hepatocellular carcinoma (HCC); To explore its anti-liver cancer mechanism.The active components ofDecoction and predicted targets, as well as the differentially expressed lncRNAs, miRNAs, and miRNAs of HCC were obtained by Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform (TCMSP), GEO, miRDB, miRTarBase and TargetScan databases. Furthermore, R language and Perl software were chosen to screen the key lncRNAs, miRNAs and mRNAs forDecoction for the treatment of HCC. With the help of Cytoscape 3.7.0 software and STRING database, the active components-target network, lncRNA-miRNA-mRNA regulatory network and protein-protein interaction network were built. GO and KEGG enrichment analysis were performed, and combined with molecular docking to construct integrated analysis.A total of 97 active components and 42 targets were obtained inDecoction for the treatment of HCC, and a lncRNA-mRNA-miRNA regulatory network composed of 19 key lncRNAs, 23 key miRNAs, and 42 key mRNAs was built. Enrichment analysis showed that these important target genes were involved in tumor survival, apoptosis, autophagy, oxidative stress, protein kinases and other biological processes, and mainly played a therapeutic role through PI3K-Akt signaling pathway, MAPK signaling pathway and TNF signaling pathway.This study indicates the characteristics ofDecoction treatment of HCC with multi-components, multi-targets, and multi-pathways synergistic therapy, and can provide basis and direction for future research.

hepatocellular carcinoma;Decoction; transcriptional network; bioinformatics; network pharmacology; molecular docking

R273.57；R285

A

1005-5304(2021)12-0022-08

10.19879/j.cnki.1005-5304.202104055

湖南省自然科学基金（2020JJ4066）；湖南省研究生科研创新项目（CX20190541）；湖南中医药大学中西医结合一流学科开放基金（2018ZXYJH03）

田雪飞，E-mail：003640@hnucm.edu.cn

（2021-04-04）

（修回日期：2021-06-08；编辑：陈静）