蟾毒灵抑制肝癌干细胞lncRNAs分子筛选研究

王海永，张晨月，李佳，部帅，李成，赵成龙

蟾毒灵抑制肝癌干细胞lncRNAs分子筛选研究

王海永1，张晨月2，李佳3，部帅4，李成1，赵成龙1

1.山东省肿瘤防治研究院，山东 济南 250117；2.复旦大学附属肿瘤医院，上海 200032；3.郑州大学附属肿瘤医院，河南 郑州 450003；4.山东中医药大学第二附属医院，山东 济南 250001

观察蟾毒灵对肝癌干细胞的影响，并探讨其相关机制。方法 利用无血清悬浮培养技术富集肝癌干细胞球，分子生物实验检测肿瘤干细胞标记物CD133、CD44和上皮特异性抗原（ESA）表达，测序技术筛选蟾毒灵干预肝癌干细胞后lncRNAs分子的差异表达。结果 通过无血清悬浮培养方法成功富集肝癌干细胞球，进一步发现蟾毒灵可抑制肝癌干细胞球的形成；蟾毒灵能显著抑制肝癌干细胞标记物CD133、CD44和ESA表达；测序结果显示，蟾毒灵可引起肝癌干细胞lncRNAs分子的差异表达。结论 蟾毒灵具有抑制肝癌干细胞的作用，其机制可能与调控lncRNAs分子有关。

蟾毒灵；肝癌干细胞；长链非编码RNA

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是全球恶性程度最高的肿瘤之一[1]。由于其症状不明显且具有非特异性，大多数HCC患者就诊时已处于晚期，因而失去最佳治疗时机。迄今为止，HCC发生发展的机制仍未完全明确[2]。研究表明，肝癌干细胞在促进HCC发生发展中扮演重要角色，HCC的复发与肝癌干细胞的浸润密切相关[3]。

肿瘤干细胞的调控过程十分复杂。研究表明，长链非编码RNA（lncRNA）可通过多种机制调控不同种类肿瘤中的干细胞[4]。lncRNA是一组至少具有200个碱基但不具备翻译蛋白质功能的转录本，可通过与miRNA、mRNA和蛋白质的相互作用调节基因表达[5]。lncRNA具有促进和抑制肿瘤发生发展的双重作用。研究表明，降低lncRNA H19表达可逆转CD133+肿瘤干细胞所致化疗耐受性[6]。此外，lncRNA HOTTIP可通过调控Wnt/catenin通路影响胰腺癌干细胞的特性[7]。

蟾毒灵可在抑制肝癌血管生成、侵袭和转移及诱导肝癌细胞凋亡等方面发挥作用[8-10]，然而，其对肝癌干细胞的作用及其与lncRNAs的相关性鲜有报道。本研究观察蟾毒灵对肝癌干细胞的影响，并筛选其可能调控的lncRNAs分子。

1 实验材料

1.1 细胞和药物

人肝癌细胞PLC/PRF/5，购自中国科学院上海细胞库。蟾毒灵，德国Sigma Aldrich，货号B0261。

1.2 主要试剂与仪器

CD133，德国Miltenyi公司，货号170-070-702；CD44，德国Miltenyi公司，货号170-078-029；上皮特异性抗原（ESA），德国Miltenyi，货号130-110-998；4%多聚甲醛，上海碧云天生物技术有限公司，货号P0099；0.1%结晶紫溶液，北京索莱宝，货号G1064；TRIzol®试剂，美国Invitrogen公司，货号10296010。FACSA流式细胞仪（美国BD公司），2100生物分析仪（美国Agilent公司），ND2000超微量分光光度计（美国Thermo Scientific公司），移液枪（美国Thermo公司），3-18KS高速低温离心机（美国Sigma公司），CO2细胞培养箱（美国Thermo公司）。

2 实验方法

2.1 肝癌干细胞球培养

采用无血清悬浮培养分离肝癌干细胞，并富集肝癌干细胞球。将生长良好的PLC/PRF/5细胞消化后离心，弃去含血清培养基，PBS清洗，用不含血清的肿瘤干细胞培养基重悬，细胞计数，取1×103个PLC/PRF/5细胞，加入超低吸附细胞培养皿中培养，观察细胞成球状态[11]。

2.2 肝癌干细胞鉴定

将1×103个PLC/PRF/5细胞和肝癌干细胞分别接种至6孔板，加入含10%胎牛血清的DMEM培养基培养，每3 d更换1次培养基，14 d后观察2组细胞克隆形成情况。PBS清洗细胞，4%多聚甲醛固定，0.1%结晶紫溶液染色15 min，PBS清洗3次，晾干。由2位研究人员读取克隆数目。

0.25%胰蛋白酶消化2组细胞，100 μL PBS重悬，加入CD133、CD44和ESA一抗（均为1∶100），4 ℃避光孵育15 min；PBS洗涤3次，加入二抗（1∶1 000）孵育15 min；PBS洗涤，流式细胞仪检测肿瘤干细胞标记物CD133、CD44和ESA表达。

2.3 肝癌干细胞增殖能力检测

将肝癌干细胞分为对照组和蟾毒灵组，分别加入正常培养基和含5 nmol/L蟾毒灵的正常培养基培养24 h，统计干细胞球数目。

2.4 肿瘤干细胞标记物检测

将肝癌干细胞分为对照组、5 nmol/L蟾毒灵组和20 nmol/L蟾毒灵组，分别加入相应药物培养，Western blot检测CD133、CD44和ESA表达。

2.5 RNA提取和测序

将肝癌干细胞分为对照组、5 nmol/L蟾毒灵组和20 nmol/L蟾毒灵组，分别加入相应药物培养，TRIzol试剂提取总RNA，加入DNaseⅠ去除基因组DNA；生物分析仪测定RNA质量，超微量分光光度计对RNA进行定量。用高质量RNA样品（OD260/280＝1.8～2.2，OD260/230≥2.0，RNA完整值≥6.5，28 S∶18 S≥1.0）构建测序文库。实验由上海凌恩生物科技有限公司协助完成。

2.6 差异通路GO富集分析

使用Goatools软件（https://github.com/tanghaibao/ GOatools）对3组lncRNAs进行富集分析，采用Fisher精确检验。为控制计算的假阳性率，共使用4种多重检验方法（Bonferroni、Holm、Sidak和false discovery rate）对值进行校正，当≤0.05时，认为此GO功能存在显著富集情况。

3 统计学方法

4 结果

4.1 肝癌干细胞富集和鉴定结果

本研究采用无血清悬浮培养成功培养出肝癌干细胞球，见图1。克隆形成实验显示，肝癌干细胞克隆形成能力明显增强（＜0.05），见图2。流式细胞仪检测结果显示，CD133、CD44和ESA在肝癌干细胞中的表达明显高于PLC/PRF/5细胞，表达CD133、CD44和ESA的PLC/PRF/5细胞分别为2.0%、1.9%、1.1%，表达CD133、CD44和ESA的肝癌干细胞分别为18.4%、95.1%和57.7%，见图3。

图1 肝癌干细胞球形态（×200）

图2 2组肝癌细胞克隆形成数目比较（±s，n＝3）

图3 2组肝癌细胞CD44、ESA和CD133表达比较（±s，n＝3）

4.2 蟾毒灵对肝癌干细胞增殖和相关标记物表达的影响

与对照组肝癌细胞比较，5 nmol/L蟾毒灵干预后，肝癌干细胞球数目明显减少，见图4。Western blot结果显示，5、20 nmol/L蟾毒灵均可显著抑制CD133、CD44和ESA表达，见图5。

4.3 蟾毒灵对肝癌干细胞lncRNAs表达的影响

与对照组比较，5、20 nmol/L蟾毒灵组均能引起肝癌干细胞lncRNAs分子的差异表达。见图6。

图4 2组肝癌干细胞增殖能力比较（±s，n＝3）

图5 2组肝癌干细胞CD133、CD44和ESA表达比较（±s，n＝3）

图6 蟾毒灵对人肝癌干细胞相关lncRNAs分子的影响

5 讨论

研究表明，lncRNA主要参与干细胞调节[12]。本研究通过体外实验探讨蟾毒灵对肝癌干细胞的作用，结果提示lncRNA与肝癌干细胞之间具有相关性。肿瘤干细胞仅占肿瘤细胞中一小部分，因具有自我更新、分化和转移的能力而有别于其他肿瘤细胞[13]。肿瘤干细胞标记物CD44、CD24和ESA在胰腺癌中首次被发现[14]。此后，作为肿瘤干细胞标记物的CD133、CXCR4、CXCR1、ABCG2、ALDH1和Nestin等被逐步鉴定[15]。已有研究致力于探索肿瘤干细胞形成和调节的潜在机制。lncRNA参与了多个生物学过程，主要通过调控转录组水平发挥作用[16]。肝癌干细胞的表型和功能可由lncRNAs直接或间接调控。

关于lncRNAs在肿瘤干细胞中的作用和功能的研究还处于起步阶段。已有研究表明，lncRNAs的异常表达可通过转化为恶性表型而导致肿瘤进展[17]。目前，lncRNAs对肿瘤干细胞的作用主要集中在肺癌、前列腺癌、乳腺癌和胶质瘤上，具体机制包括组蛋白修饰、SOX2/KLF4途径的调控、上皮-间质转化的诱导及其与miRNA的相互作用[18-19]。此外，研究发现，lncRNAs可根据肿瘤类型通过不同方式调节肿瘤干细胞功能[20]。

综上所述，本研究结果提示，蟾毒灵可能通过调节lncRNAs分子表达降低肝癌干细胞比例，发挥治疗HCC的作用。对lncRNAs分子的深入研究可为治疗HCC提供更多新的靶点。

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Study on Screening of lncRNAs Involved in the Inhibitory Effect of Bufalin on Hepatocellular Carcinoma Stem Cells

WANG Haiyong1, ZHANG Chenyue2, LI Jia3, BU Shuai4, LI Cheng1, ZHAO Chenglong1

To investigate the effects of bufalin on hepatocellular carcinoma stem cells; To discuss the possible mechanism.Hepatocellular carcinoma stem cells spheres were enriched by serum-free suspension culture. Molecular biological experiments were used to detect the expressions of tumor stem cell markers CD133, CD44 and ESA in vitro, and sequencing technique was used to screen the differential expression of lncRNAs in hepatocellular carcinoma cells treated with bufalin.Hepatocellular carcinoma stem cells spheres were successfully enriched by serum-free suspension culture. Bufalin inhibited the formation of hepatocellular carcinoma cells spheres, and the expression of hepatocellular carcinoma stem cells markers CD133, CD44 and ESA were inhibited by bufalin in vitro. Sequencing result showed that bufalin induced the differential expression of lncRNAs.Bufalin can inhibit hepatocellular carcinoma stem cells, and the mechanism may be related to the regulation of lncRNAs.

bufalin; hepatocellular carcinoma stem cells; lncRNAs

R285.5

A

1005-5304(2021)12-0041-04

10.19879/j.cnki.1005-5304.202104541

山东省重点研发计划（2018GSF119014）；山东省泰山学者基金（tsqn201812149）；山东第一医科大学学术提升计划（2019RC004）

（2021-04-27）

（修回日期：2021-06-01；编辑：华强）