几株益生菌的性能比较研究

谢 曈，吕虹雨，朱佳佳，郝智慧*

(1.中国农业大学动物医学院，北京 100193；2.新疆农业大学动物医学院，新疆乌鲁木齐 830052)

在畜禽养殖业上，抗菌药物在促进动物生长、预防疾病和治疗疾病中都发挥着重要作用[1]。但长期使用或滥用抗菌药物，会使抗菌药物残留于肉产品或者粪污之中，并通过食物链传播，最终影响人类的健康[2]。抗菌药物耐药性问题已经成为了21世纪人类面临最大的挑战[3]。因此，在预防动物疾病时，减少抗菌药物的使用，并寻找抗菌药物代替品越发重要。而益生菌作为一种能够抑制病原菌生长、并维持畜禽肠道微生态的平衡的新型微生物制剂[4]，能够产生各种酶物，发挥抗感染作用[5]，并且增强畜禽免疫力、抵御应激，还对代谢产物发挥解毒作用[6]，在兽医临床上，可作为抗菌药物的良好代替品。但是对于制备出性能较好的益生菌产品，益生菌菌种的性能非常重要，基于此，本试验以10株益生菌为材料，比较研究其繁殖能力、产酸能力、抑菌能力、耐高温能力以及在模拟胃液中的存活能力，筛选出具有良好益生作用的候选菌株，为益生菌制剂的制备提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 5株植物乳杆菌IMAU70010(Lab2)、IMAU30151(Lab3)、IMAU80076(Lab4)、IMAU80184(Lab8)、IMAU80002(Lab13)和屎肠球菌S10-4 2009.10.29(S11)，由内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室惠赠；屎肠球菌NCIMB 10415(CLC-J)、DSM 7134(BDY-J)、FLC(AY-J)、以及双歧杆菌ND(MMA-J)购自市场。

1.1.2 主要培养基及配制 MRS肉汤培养基(1 000 mL)：葡萄糖20 g，蛋白胨15 g，牛肉膏15 g，酵母膏7.5 g，乙酸钠7.5 g，柠檬酸铵2 g，磷酸氢二钾2 g，硫酸镁0.3 g，pH 6.8。MRS琼脂培养基(1 000 mL)：葡萄糖20 g，蛋白胨15 g，牛肉膏15 g，酵母膏7.5 g，乙酸钠7.5 g，柠檬酸铵2 g，磷酸氢二钾2 g，硫酸镁0.3 g，琼脂15 g，pH 6.8。LB肉汤培养基(1 000 mL)：NaCl 10 g，蛋白胨10 g，酵母膏5 g。

1.1.3 其他试剂 模拟胃液的配制：取2.0 g氯化钠和3.2 g胃蛋白酶(标识应为800 U/mg～2 500 U/mg)，加7.0 mL盐酸和水使溶解至1 000 mL，该溶液pH应为1.2。

1.1.4 主要仪器及设备 pH计，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司产品；紫外分光光度计，上海天美科学仪器有限公司产品；水浴锅，常州国华电器有限公司产品；恒温振荡器，上海福玛实验设备有限公司产品；恒温培养箱，上海三发科学仪器有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 菌株的活化、纯化及保藏 从-80 ℃冰箱中取出冻存的菌株，待自然溶化后，取10 mL冻存菌液于100 mL MRS肉汤培养基中，37 ℃、160 r/min摇床培养活化。

1.2.2 菌株的生长能力和产酸能力测定 取10 mL已纯化的试验菌液于100 mL的MRS肉汤中，37 ℃、160 r/min条件下培养，分别在0、3、6、8.5、12、14、17、20、24 h取样，对其产酸能力和菌体生长繁殖能力进行评价。产酸能力测定：取培养液20 mL，8 000 r/min离心15 min，除去菌体，用pH计测定培养液的pH。生长繁殖能力测定：取培养液10 mL，用紫外分光光度计进行测定，以空白培养基为对照，测定培养液的OD值。

1.2.3 菌株抑制大肠埃希氏菌和金黄色葡萄球菌的试验 将大肠埃希氏菌和金黄色葡萄球菌接种到LB肉汤中进行培养，分别在37 ℃、180 r/min条件下振荡培养18 h获得菌悬液。取100 μL大肠埃希氏菌菌悬液接种于MRS琼脂培养基，用涂布棒涂布均匀后，在培养皿内等距放入4个牛津杯，静置一会，再取200 μL乳酸菌菌悬液加入到牛津杯中，静置10 min。于37 ℃培养24 h，观察培养皿中牛津杯周围是否有抑菌圈出现，并采用游标卡尺测定抑菌圈的直径。

1.2.4 菌株在模拟胃液条件下的存活率试验 菌株活化后，在MRS肉汤中，37 ℃、160 r/min条件下培养至浑浊，取0.5 mL菌悬液加入到4.5 mL模拟胃液中进行培养，以正常培养条件为对照，并分别于0、10、20、30、60 min采用平板计数法进行活菌计数。

1.2.5 菌株在不同高温条件中的试验 取已纯化的菌株10 mL，于100 mL MRS肉汤培养基中，以常温下培养为对照，然后分别在40、45、50、55、60、65 ℃水浴下，振荡培养1 h，采用平板计数法对不同温度条件下的培养的菌株进行活菌计数，比较各菌株在不同高温环境下的存活能力。

1.2.6 数据处理与统计分析 采用EXCEL进行数据统计，运用GraphPad 5进行作图分析。数据通过SPSS进行显著性分析，并进行LSD与Duncan′ s 多重比较，以P<0.05和P<0.01差异显著为显著性和极显著性判断标准，数据结果以平均值±标准差表示；其中活菌数只以平均值进行表示。

2 结果

2.1 菌株的生长能力和产酸能力试验结果

菌株的生长能力和产酸能力是判断菌株活性的指标，结果如图1所示。4种市售的益生菌(3种屎肠球菌和1种双歧杆菌)的菌株生长能力相对较优，且CLC-J>AY-J>BDY-J>MMA-J，S11生长能力最弱(OD值小于2)，其余5种植物乳杆菌菌株生长能力居中(OD值的范围)。菌株的pH曲线(图1B)反映10株菌株的产酸效果，5株植物乳杆菌的产酸效果差异不大，pH在8.5 h后均到达了4以下，S11培养24 h后，pH变化微小，而4种产品的pH在24 h后均达到5左右。

图1 10株菌株在不同时间下的生长变化和pH

2.2 10株菌株对大肠埃希氏菌和金黄色葡萄球菌的抑制试验结果

本研究选择2种动物肠道中主要的病原菌大肠埃希氏菌和金黄色葡萄球菌作为致病菌，筛选出对这2种致病菌有抑制效果的乳酸菌菌株。在大肠埃希氏菌和金黄色葡萄球菌的活菌为1×108CFU/mL时，乳酸菌对两者的抑制效果见表1。CLC-J和BDY-J对大肠埃希氏菌和金黄色葡萄球菌的抑制效果最好，分别达到了24.21 mm±0.12 mm、22.16 mm±0.21 mm和25.09 mm±0.03 mm、23.19 mm±0.23 mm，Lab8和Lab13对大肠埃希氏菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈达到24.16 mm±0.33 mm、24.31 mm±0.24 mm和23.26 mm±0.16 mm、23.08 mm±0.05 mm， AY-J和Lab2、Lab3、Lab4的抑菌效果次之，抑菌效果较差的为MMA-J和S11。整体来看，各菌株对金黄色葡萄球菌的抑制效果较大肠埃希氏菌好。

表1 10株菌株对金黄色葡萄球菌和大肠埃希氏菌的抑菌效果

2.3 菌株在模拟胃液条件下的存活率试验结果

通过菌株在模拟胃液条件下的存活试验，以获得可以在胃中稳定存活的菌株。比较不同时间点菌株的耐酸效果，得出不同的菌株耐酸性随着时间的变化情况(表2)。随着时间的推移，所有菌株在模拟胃液中的菌落数都有不同程度的降低。其中以BDY-J在60 min后的活菌数达到8.45×104CFU/mL，S11号在20 min后活菌数已减少到112 CFU/mL；在酸处理10 min后，CLC-J、BDY-J和Lab13菌株活菌数均在107CFU/mL以上，从整体来看，所有的菌株在模拟胃液条件下的活菌数菌显著下降，耐酸效果均不理想。

表2 10株菌株在模拟胃液中不同时间处理的耐受效果

2.4 菌株在不同温度条件中的试验结果

10株菌株在不同温度下水浴处理1 h后,在40 ℃左右菌株均可以正常生长，高于40 ℃，各菌株活菌数均开始减少，BDY-J在高于50 ℃时，活菌数仍可达到3.68×106CFU/mL、CLC-J的活菌数达到2.31×106CFU/mL、AY-J的活菌数达2.52×106CFU/mL。Lab13菌株耐50 ℃高温的活菌数达1.5×106CFU/mL(表3)。

表3 不同温度下10株菌株的耐高温结果

3 讨论

外源益生菌定植肠道需要耐受胃肠道中的pH环境及消化酶[7]的影响，且益生菌容易受到外界环境的影响，如保存过程中活菌数下降导致到达肠道有效部位的菌群数降低，无法发挥益生菌的益生作用。因此，益生菌制剂的制作对益生菌提高抗逆性、充分发挥益生作用具有重要影响[8]，而理想的制备益生菌制剂的菌株应具有稳定的繁殖和产酸能力、在消化道目标位置存活、产生抗菌物质、与病原菌拮抗起到抑菌效果，且在制剂制作过程中能具有稳定性。

菌株的生长能力和产酸能力是判断菌株活性的指标。菌株生长能力是用于判断菌株到达肠道之后快速繁殖的能力，菌株的生长繁殖能力越强，在到达肠道后，繁殖越具有优势。益生菌的活菌期短，是其很大的一个问题[9]。本试验发现，10株益生菌均能在培养基中稳定生长，说明其生长能力较好。

益生菌产生的有机酸是其发挥益生作用的重要机制之一，近年来越来越受到重视[10]，且许多益生菌是靠有机酸的生成来发挥阻碍致病菌生长作用的[11]。研究发现[12]，发酵乳杆菌后最终的菌液pH值在4.3左右，发酵乳杆菌YPH·1-3-3最终pH为4.1[13]。本研究发现的5株植物乳杆菌(lab2、lab3、lab4、lab8、lab13)的pH在24 h内均小于4，说明其产酸能力具有部分优势。

此外，菌株的抑菌能力是益生菌筛选的重要指标[14]。金黄色葡萄球菌和大肠埃希氏菌是肠道常见的致病菌，本试验发现各菌株对2种致病菌的抑制作用都良好，金黄色葡萄球菌的抑制效果均好于大肠埃希氏菌，BDY-J、Lab8、Lab13对大肠埃希氏菌和金黄色葡萄球菌的抑制效果最好。有研究筛选出的粪肠球菌对大肠埃希菌也能产生抑制效果，最大抑菌圈直径达18.33 mm[15]，而本试验选出的几种益生菌的抑菌效果更好。而对于金黄色葡萄球菌，有研究筛选出的植物乳杆菌也能对金黄色葡萄球菌产生抑制效果，抑菌圈直径为13.33 mm±0.29 mm[16]，而本试验的益生菌产生抑菌效果也更佳。

动物的胃肠道环境较为复杂，胃液的酸性环境会对益生菌的存活产生影响，因此，菌株的耐酸性也是评价乳酸菌的一个重要指标[17]。本试验发现，在pH 1.2的模拟胃液环境下，活菌数下降较快，在10 min后，Lab13菌株活菌数最大，而后CLC-J、BDY-J菌株的活菌数也均在107CFU/mL以上，60 min后，10株益生菌在胃液的酸性环境的存活能力都较为不佳，只有BDY-J的活菌数达到8.45×104CFU/mL。另有研究发现植物乳杆菌KLDS1.0318在pH 1.5条件下活菌数下降较快,培养至3 h其活菌数对数值降为零[18]。

植物乳杆菌的适宜温度为中温[19]，益生菌的高温耐受性的研究相对较少，而一般认为在30 ℃到40 ℃左右为最合适的生长温度。菌株的耐高温能力的比较反映的是菌种在后期储存、加工过程中的稳定性。有研究表明，屎肠球菌的最低生长温度为4.8 ℃,最高生长温度为54.6 ℃,最适生长温度为41 ℃[20]。本试验发现在40 ℃左右菌株均可以正常生长，高于40 ℃则各菌株活菌数均开始减少，其中BDY-J在高于50 ℃时，活菌数仍可达到3.68×106CFU/mL，Lab13菌株耐50 ℃高温的活菌数达1.5×106CFU/mL。通过耐高温试验结果说明，益生菌在超过一定温度的环境中，生长受到限制，繁殖能力被破坏，使得活菌数下降，而BDY-J和Lab13号菌株在温度较高时的耐热能力比其他菌株更强。