蒲桃花提取物清除自由基活性研究

刘 茜

(梧州学院 化学工程与资源再利用学院，广西 梧州 543002)

自由基是生命活动时所产生的一种带有未成对电子的基团，在生命体的新陈代谢过程中，自由基对机能的平衡调节发挥着重要作用。但是，如果生命体内有过多的自由基，也会对生命体造成伤害，它会使蛋白质、核酸(DNA)变性等，也会加速生命体的衰老进程和各种疾病的产生[1-5]。为此，研发高效无毒、天然的自由基清除剂更符合大众对绿色安全保健品的意愿。蒲桃，为桃金娘科植物，又名水蒲桃、水石榴，香果等，学名为Syzygiumjambos(L.)Alston，热带亚热带多年生的常绿乔木[6]。蒲桃的花期为3、4月，观赏价值高，蒲桃的地上部分，除茎之外的其他部位均可入药。《本草再新》中记载蒲桃“味甘酸﹐性热,无毒;入脾﹑肺二经;暖胃健脾。治肺虚寒嗽，破血积疽瘤。”蒲桃中含有对自由基具有良好清除活性的黄酮类、多酚类等，这为蒲桃开发为天然无毒的抗氧化剂提供了物质基础[7-9]。为此，本试验采用乙酸乙酯、无水乙醇、蒸馏水3种不同极性溶剂对蒲桃花进行超声提取，通过比较所得提取物对自由基的清除作用，分析不同极性溶剂对提取物清除自由基的影响，为深入研究蒲桃花活性成分的提取及其抗氧化活性提供参考。

1 材料与方法

1.1 试剂、仪器及原料

1,1-二苯基-2-苦基肼(DPPH，上海金穗生物科技有限公司)；2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS，上海金穗生物科技有限公司)；其余试剂均为分析纯。

SB-5200D超声清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司)，752N紫外分光光度计(上海仪电分析仪器有限公司)，DF-101S型集热式磁力加热搅拌器(金坛市晶玻实验仪器厂)，低温冷却液循环泵(郑州长城科工贸有限公司)，旋转蒸发器(上海申生科技有限公司)。

蒲桃花，采集于梧州学院旦冲蒲桃果园。

1.2 蒲桃花提取物的制备

采摘新鲜蒲桃花，经梧州学院植物学教师鉴定为桃金娘科属的蒲桃〔Syzygiumjambos(L.)Alston〕花，60℃恒温干燥8 h，粉碎。称取3份10.0 g粉碎后的蒲桃花分别加入乙酸乙酯、无水乙醇、蒸馏水各150 mL，常温下超声辅助提取1 h，提取液抽滤，滤液经减压浓缩至10 mL，浓缩液自然挥发剩余溶剂，分别得到提取物EAE、AAE和DWE。

1.3 蒲桃花提取物对DPPH·清除作用试验

参考文献，根据不同极性溶剂得到的提取物对DPPH·清除能力的不同，配制相应的蒲桃花提取物的系列质量浓度溶液，分别将各质量浓度溶液与DPPH·溶液混合暗处避光反应30 min，立刻测混合液在波长为517 nm下的吸光度，重复试验3次[5,10-12]。根据试验数据，以质量浓度为横坐标、自由基清除率为纵坐标，拟合得 DPPH·清除率与不同极性溶剂提取物的浓度关系曲线(图1)。根据曲线方程，算出不同极性溶剂所得提取物对DPPH·半抑制质量浓度IC50值(表1)，并与标准抗氧化剂BHT(2,6-二叔丁基对甲酚)的IC50值对比。

图1 蒲桃花提取物对DPPH·的清除作用 图2 蒲桃花提取物对ABTS+·的清除作用

1.4 蒲桃花提取物对ABTS+·清除作用试验

参考文献，制备ABTS+·储备溶液，同时根据不同极性溶剂得到的提取物对ABTS+·清除能力的不同，配制相应的蒲桃花提取物的系列质量浓度溶液，取ABTS+·储备液1.9 mL与各浓度浸膏溶液0.1 mL在室温暗处混合3 min，然后立刻测混合液在波长为734 nm下的吸光度，重复实验3次[5,12]。根据试验数据，以质量浓度为横坐标、自由基清除率为纵坐标，拟合得ABTS+·自由基清除率与不同极性溶剂提取物的浓度关系曲线(图2)，根据曲线方程，算出不同极性溶剂所得提取物对ABTS+·半抑制质量浓度IC50值(表1)，并与标准抗氧化剂BHT的IC50值对比。

1.5 蒲桃花提取物对·OH清除作用试验

参考文献，根据不同极性溶剂得到的提取物对·OH清除能力的不同，配制相应的蒲桃花提取物的系列质量浓度溶液，测定各质量浓度的蒲桃花提取物溶液与利用Fenton试剂产生的·OH作用后在波长为510 nm下的吸光度，重复实验3次[5,13]，并根据Fenton法的计算公式计算其清除率，根据试验数据，以质量浓度为横坐标、自由基清除率为纵坐标，拟合得·OH清除率与不同极性溶剂提取物的浓度关系曲线(图3)，根据曲线方程，算出不同极性溶剂所得提取物对·OH半抑制质量浓度IC50值(表1)，并与标准抗氧化剂BHT的IC50值对比。

图3 蒲桃花提取物对·OH的清除作用

2 结果与讨论

为保证试验数据的准确，对同一批次采集到的蒲桃花进行提取物对自由基清除作用的测定时，每个浓度溶液平行测定3次，确保数值在相对误差允许范围内，排除偶然误差对本试验的干扰，最后取平均值，即为该浓度下水蒲桃花提取物对自由基的清除作用值。

衡量物质抗氧化能力的重要指标是对各类自由基如DPPH·、ABTS+·和·OH的清除能力。试验中，常用物质清除50%自由基的质量浓度来衡量其清除自由基的活性。半抑制剂量IC50值越大，表明该物质清除自由基的活性越低，而当物质的IC50<10 mg/mL时，表明其与自由基相互作用强，有良好的自由基清除活性[5，13]。同时，与标准抗氧化剂BHT的IC50对比也能说明抗氧化剂的清除活性。

此外，探讨溶剂效应对提取物活性成分不同的影响，再进一步探讨活性成分不同而导致其与自由基的作用程度的不同，对于准确评估蒲桃花提取物的抗氧化活性具有一定的试验意义，故我们在试验中用3种不同极性溶剂对蒲桃花活性成分进行提取，并对比3种提取物对自由基作用情况。

2.1 蒲桃花提取物清除DPPH·的结果

DPPH·是一种蓝紫色而相对较稳定的自由基，随着自由基清除试剂的加入，DPPH·最大吸收波长的吸光度会相应地降低。因此，可通过其与自由基清除试剂相互作用后的吸光度变化来评价清除试剂的抗氧化能力。从表1和图1中可知不同提取试剂得到的蒲桃花提取物EAE、AAE和DWE对DPPH·的清除效果，随提取物质量浓度的增加清除率也在增大。与标准值10 mg/mL及标准抗氧化剂BHT的IC50值(14.50 mg/mL)[11]比较，3种不同极性溶剂得到的提取物对DPPH·的IC50值更小，分别为0.130，0.014，0.044 mg/mL，说明3种不同极性溶剂得到的提取物对DPPH·均有良好的清除活性，特别是无水乙醇和蒸馏水为溶剂所得的提取物的清除效果相当明显，远大于乙酸乙酯为提取溶剂的清除效果。提取物的清除活性顺序为AAE > DWE>> EAE。对比这3种不同极性溶剂得到的提取物清除活性可知，以无水乙醇提取得到的提取物对DPPH·的清除能力最强，蒸馏水的次之，最差的是乙酸乙酯所得提取物。从溶剂极性来看，无水乙醇和蒸馏水的极性较大，乙酸乙酯极性较小，而AAE和DWE对DPPH·的清除能力明显比EAE强，实验数据说明极性大的溶剂所得提取物对DPPH·的清除活性更大。

2.2 蒲桃花提取物清除ABTS+·的结果

测量物质抗氧化活性的另一重要指标是对ABTS+·自由基的清除活性。根据表1和图2中数据分析：蒲桃花提取物EAE,AAE和DWE对ABTS+·也表现出良好的清除活性，随提取物浓度的增加，清除率也在增加，各提取物的IC50值分别为0.210，0.016，0.066 mg/mL，远远低于标准的抗氧化剂BHT的IC50值81.43 mg/mL[11]和衡量物质是否有清除活性的标准值10 mg/mL，各提取清除活性顺序为AAE > DWE >EAE。从试验数据可得：提取溶剂极性对提取物的ABTS+·的清除活性的影响与清除DPPH·的相似，极性大的无水乙醇和蒸馏水所得的提取物清除ABTS+·的活性更大。

2.3 蒲桃花提取物清除·OH的结果

依据表1和图3的数据，在对·OH的清除活性试验中，蒲桃花提取物对·OH同样具有良好的清除活性，3种提取物对·OH的清除活性的IC50值分别为1.44，0.77，0.97 mg/mL，均低于标准值10 mg/mL。从试验数据可知，提取物对·OH的清除活性依然受提取溶剂极性的影响，随着溶剂极性的变小，浸膏对·OH清除的IC50值也在增大，清除活性变小，其对·OH的清除活性顺序为AAE > DWE >EAE。

表1 蒲桃花提取物和BHT的IC50 mg/mL

3 结论

本试验结果表明不同极性溶剂提取所得的蒲桃花中的活性物性对3种自由基作用结果有着一定的差别。本试验中，对自由基表现出最好的清除活性是以无水乙醇为溶剂得到的蒲桃花提取物(AAE)，蒸馏水的(WAE)次之，乙酸乙酯为溶剂得到的桃花提取物(EAE)的自由基清除活性稍差。分析试验数据可知：极性大的溶剂所得提取物清除3种自由基的活性相对大些，可初步推断蒲桃花中的活性成分的极性稍大。这为今后蒲桃的综合开发和利用提供了一定的理论基础。