玉米NAM-2基因的克隆及生物信息学分析

杨晓艺，鹿锦浩，王聪，吕绍芝，林海东，宋希云，裴玉贺

(青岛农业大学农学院， 山东青岛 266109)

NAC转录因子家族是植物中常见的转录因子家族[1]，是由矮牵牛(PetuniahybridaVilm)的NAM基因、拟南芥(Arabidopsisthaliana)的ATAF1/2基因和CUC1/2基因的首字母缩写命名[2]。保守的NAC结构域存在于NAC蛋白的N端，按保守程度分为A-E 5个亚结构域，A、C、D高度保守，B、E相对可变，长度在150个氨基酸左右，可以与DNA或蛋白质结合[3]。在NAC蛋白的C端，则存在高度可变的转录激活域或抑制域，这类结构内含有大量的脯氨酸、苏氨酸、丝氨酸等氨基酸，可以控制转录过程[4]。

目前，在玉米、小麦和拟南芥等物种中发现了许多NAC转录因子，其中玉米中发现的NAC转录因子超130种。前人研究发现NAC类转录因子可以调控玉米的叶片发育、花药开裂、逆境生理等，从而影响玉米产量[5-7]。如ZmNAC1可以受外界干旱、ABA等非生物条件诱导提高玉米的抗旱能力[8]；ZmNAM调控玉米根部的生长发育[9]；ZmSNAC1激活胁迫相关基因的表达并引起代谢产物积累，从而提高植物对非生物胁迫的抗性[10]。玉米作为重要的粮食作物，研究NAC转录因子对玉米非生物胁迫的响应机制，为培育高产高抗的玉米品种奠定基础。

本研究从抗性玉米自交系‘辽3162’中克隆出NAC转录因子基因NAM-2，通过对NAM-2蛋白的理化性质、空间结构和亲缘关系的分析，预测该基因可能具有的功能。利用NaCl和PEG 6000模拟盐和干旱胁迫，探索非生物胁迫下该基因的表达特性，为NAC转录因子家族的研究提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料的处理及取样

取大小均匀、颗粒饱满的玉米自交系‘辽3162’种子种植在发芽盒中，培养条件设置为(25±2) ℃，16 h光照/8 h黑暗，相对湿度70%，培养至三叶一心时用浓度为250 mmol/L的NaCl溶液和20% PEG 6000溶液浇灌分别进行盐和干旱胁迫处理，在处理0 h、3 h、6 h、9 h、12 h、24 h后，收集玉米幼嫩的根、茎、叶组织，放置在-80 ℃超低温冰箱备用。

1.2 RNA的提取及cDNA的合成

将超低温冻存的玉米组织样品充分研磨成粉末，使用TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit[宝生物工程(大连)有限公司, 大连]提取样品的 RNA。用Nanodrop 2000超微量分光光度计(美国赛默飞世尔，美国) 和1% 的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的浓度、纯度和质量。用HiScript®II Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司，南京)进行cDNA的合成。

1.3 NAM-2基因的克隆

根据NAM-2基因的核酸序列，用Primer premier 5软件设计用于该基因克隆的特异性引物(表1)。以得到的 cDNA 为模板，TotalNAM-2-F/TotalNAM-2-R为引物，进行PCR扩增，采用1%的琼脂糖凝胶电泳对目的条带进行切胶纯化回收(南京诺唯赞生物科技有限公司, 南京)。将目的片段与pMD19-T克隆载体连接，转化到大肠杆菌感受态细胞DH5α中，通过PCR对菌落筛选阳性克隆，并进行测序验证。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.4 实时荧光定量PCR

通过检索获得玉米NAM-2基因序列，设计cDNA快速扩增的上下游引物(如表1所示)，用ChamQTM Universal SYBR®qPCR Master Mix(南京诺唯赞生物科技有限公司，南京)在荧光定量QuantStudio3 PCR仪(美国应用生物系统公司，美国)上进行荧光定量PCR扩增。

1.5 玉米NAM-2基因蛋白性质分析

利用ProtParam在线工具对NAM-2蛋白的理化性质进行分析，使用Protscale对亲疏水性进一步分析。利用NetPhos 3.1和NetNGlyc 1.0分析蛋白的磷酸化位点和糖基化位点分析。用SingalP 4.0和TMHMM 2.0软件进行信号肽和跨膜结构域预测。使用NCBI在线分析工具CD Search分析蛋白的保守结构域。使用PSIPRED、SOPMA、Phyre 2对蛋白进行二级结构和三级结构预测。通过在线启动子顺式作用元件预测工具PlantCARE对NAM-2基因可能存在的启动子顺式作用元件进行分析。利用 NCBI 中的 BLASTN，将此蛋白与其他植物NAC转录因子的蛋白进行序列比对，分析其序列的同源性。采用 DNAMAN 6.0 进行多序列比对，通过MEGA 6.0构建蛋白的系统发育进化树。

1.6 数据统计与分析

采用2-ΔΔCt方法[11]计算NAM-2基因在根、茎、叶中的相对表达量和胁迫处理0 h、3 h、6 h、9 h、12 h、24 h后的相对表达量。利用 SPSS16.0 软件对数据进行统计学分析，处理数据，分析差异显著性；使用Excel 2010绘制柱形图。

2 结果与分析

2.1 NAM-2基因的克隆

根据基因序列设计全长引物，以cDNA为模板对NAM-2进行PCR扩增，从玉米自交系‘辽3162’中扩增出一条长度为1 122 bp的基因序列(图1)，根据ORF finder可知该基因编码373个氨基酸。

M为Marker；1-2为扩增产物。M: Marker; 1-2: The amplification products.图1 NAM-2基因的克隆Fig. 1 Cloning of NAM-2 gene

2.2 NAM-2基因的生物信息学分析

2.2.1 NAM-2蛋白的理化性质分析

用在线工具ProtParam分析NAM-2蛋白理化性质，结果(表2)显示，玉米NAM-2蛋白分子式为C1776H2725N523O532S21，相对分子质量为 40.59 kDa，等电点为 8.70，说明玉米NAM-2蛋白是一个弱碱性蛋白质。NAM-2蛋白内包含20种常见氨基酸，其中含量最高的氨基酸为丙氨酸(Ala)，占总量的13.1%，其次为脯氨酸(Pro)和甘氨酸(Gly)，含量分别为8.6%和8.0%，含量最低的为半胱氨酸(Cys)和色氨酸(Trp)，两种氨基酸各占1.3 %。玉米NAM-2蛋白的平均亲水值为-0.573，说明玉米NAM-2蛋白应该属于亲水性蛋白。利用在线软件Protscale分析NAM-2蛋白的亲/疏水性，发现NAM-2蛋白N端含有疏水头部，C 端为亲水头部，中间氨基酸多数表现为亲水性，少数表现为疏水性，其中以A261残基亲水性最强，亲水值为-2.956，A42残基疏水性最强，亲水值为2.056。 整体上看来，峰值分布在-1以下的氨基酸明显多于1以上的氨基酸，这个结果也进一步证明玉米NAM-2蛋白为亲水性蛋白。

表2 NAM-2蛋白理化性质分析Table 2 Analysis of physical and chemical properties of NAM-2 protein

2.2.2 NAM-2蛋白的修饰位点、结构域、信号肽预测及亚细胞定位

利用在线工具NetPhos3.1分析(图2A)，发现NAM-2蛋白存在35个磷酸化位点，其中包括23个丝氨酸位点、7个苏氨酸位点和5个酪氨酸位点，可以与磷酸基团结合，传递磷酸基团。利用在线工具NetNGlyc 1.0进行糖基化位点分析(图2B)，发现NAM-2蛋白存在2个潜在的糖基化修饰位点，分别在A154和A339。使用在线软件SignalP4.1和TMHMM 2.0对玉米NAM-2蛋白的信号肽和跨膜结构域进行预测，结果表明，玉米NAM-2蛋白并不存在跨膜结构域，也未发现有信号肽，并且不存在剪切位点。因此可推测，玉米NAM-2蛋白为非分泌型蛋白，没有进行跨膜运输，直接在细胞内起作用。利用在线分析软件CD Search和InterPro对NAM-2蛋白进行保守结构域预测和检索，发现这段蛋白中含有一个典型的NAM保守结构域(图2C)，位于蛋白N端，属于NAC家族转录因子，参与转录调节，调控胚的形成和器官分离过程中茎尖分生组织的形成等[12]。利用lncLocator对NAM-2蛋白进行亚细胞定位，结果表明，玉米NAM-2蛋白最有可能定位在细胞核中。

A. 磷酸位点预测； B. 糖基化位点预测；C. 保守结构域分析A. Prediction of phosphate site; B. Prediction of glycosylation site; C. Conserved domain analysis图2 NAM-2蛋白磷酸位点、糖基化位点预测和保守结构域分析Fig. 2 Phosphate site and glycosylation site prediction, conserved domain analysis of NAM-2 protein

2.2.3 NAM-2蛋白的二、三级结构预测

使用在线软件PSIPRED和SOPMA对玉米NAM-2蛋白的二级结构进行分析，结果显示，NAM-2蛋白的氨基酸残基组成以58.18%的无规则卷曲为主，另外还还伴有25.74%的α-螺旋、11.26%的延伸链和4.83%的β-折叠。使用同源建模软件Phyre2对NAM-2蛋白的3D结构进行模拟，结果显示相似度最高的模型为c3ulxA，相似度为99.9%，然后利用在线工具SWISS-MODEL对NAM-2蛋白373个氨基酸进行3D建模，模板覆盖率为64.81%。

2.2.4 NAM-2蛋白的进化分析

利用 NCBI中的BLASTN，搜索玉米(Zeamays)与狗尾草(Setariaviridis)、小米(Setariaitalica)、柳枝稷(Panicumvirgatum)、高粱(Sorghumbicolor)、结缕草(zoysiajaponica)、红树林草(Aeluropuslagopoides)、粳稻(OryzasativaJaponicaGroup)、短花药野生稻(Oryzabrachyantha)、花毛竹(Phyllostachysedulis)、慈竹(Bambusaemeiensis)、二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)、野生二粒小麦(Triticumdicoccoides)、普通小麦(Triticumaestivum)等植物的NAM-2基因序列，采用 DNAMAN 6.0进行多序列比对，使用MEGA-X构建各植物蛋白的系统发育进化树[13]。结果表明(图3)，玉米和高粱进化关系最近，而和野生二粒小麦和普通小麦进化关系最远。

图3 玉米NAM-2蛋白的系统进化分析Fig. 3 Phylogenetic analysis of maize NAM-2 protein

2.3 NAM-2基因的表达分析

qRT-PCR分析NAM-2在不同组织中的表达，结果显示(图4)，玉米NAM-2基因在根、茎、叶3种玉米幼苗组织中均有表达，但不同部位的表达量不同，NAM-2在根中的表达量最低，在叶中的表达量最高，为根的4.67倍，茎的表达量次于叶，为根的1.96倍。对模拟盐胁迫和干旱胁迫处理后的玉米幼叶进行实时荧光定量PCR，检测不同处理时间NAM-2的表达量变化情况。结果显示(图5)，在盐胁迫处理3 h出现显著变化，6 h后NAM-2的表达量显著降低；在干旱胁迫处理之后，NAM-2的表达量在3 h显著降低，随后又有所上升，但均显著低于0 h的表达量。由此推测，玉米NAM-2基因在抵御干旱和盐胁迫过程中起重要作用。

图4 NAM-2基因在不同组织的表达量Fig. 4 The expression level of NAM-2 gene in different tissues of maize

图5 NAM-2基因在不同处理时间的表达量Fig. 5 The expression level of NAM-2 gene in different treatment time注：*表示不同时间处理与0 h 相比在P< 0.05时差异显著

3 讨论

为了研究玉米NAC转录因子对干旱胁迫和盐胁迫的响应，本研究克隆出NAC家族成员NAM-2，生物信息学分析发现该转录因子为碱性蛋白、亲水性蛋白、非分泌蛋白，这与大豆、水稻、苹果中NAC转录因子的分析结果一致[14-15]。NAM-2转录因子N端含有一个典型的NAM保守结构域，有研究表明此类保守结构域可以与DNA结合[3]。

利用qRT-PCR分析该基因在不同组织中的表达，发现NAM-2基因的表达具有组织特异性，在叶中的表达量最高，在根中最低。前人的研究表明，小麦的TaNAC-B072基因在幼根中表达量最高[16]；油菜的BnNAC5基因在茎中表达量最高[17]；番茄的SlNAC3基因在根、花和果实中表达量比其他部位高[18]；转基因烟草中的棉花GhSNAC3基因在根部表达量最高，在茎叶中表达微量[19]。这意味着不同组织中NAC基因表达情况也不同，证明NAC转录因子家族的不同成员可能在不同组织中发挥作用。

研究发现，盐和干旱胁迫后，玉米幼苗中NAM-2基因的表达显著降低，盐胁迫处理使NAM-2基因的表达量降低至初始量的1/5，干旱胁迫处理使NAM-2基因的表达量降低至初始量的2/5。在以往的研究中，发现多种NAC基因与植物中的非生物胁迫有关。例如，干旱胁迫下转基因水稻的TaNAC67基因会调节糖代谢相关基因的表达，从而提高了植物的耐旱性[20]；干旱胁迫也导致水稻ONAC022基因的表达上调，从而提高了水稻的耐旱性[21]；在高盐、干旱和寒冷胁迫下，小麦中TaNAC2基因的过表达可以提高小麦对这些非生物胁迫的耐受性[22]；蒙古冰草的AmNAC100和AmNAC102-2基因，在干旱处理下表达上调，对干旱起正调控作用[23]。因此可以判断NAC转录因子在响应植物非生物胁迫的过程中起调节作用。

4 结论

本研究从玉米自交系‘辽3162’中克隆出一个NAM-2基因并对其编码蛋白进行分析，探究此基因在盐胁迫和干旱胁迫条件下的表达变化。发现在非生物胁迫下NAM-2基因表达均下调，参与了玉米对非生物胁迫的应答反应，其编码的NAM-2蛋白属于NAC家族成员。