P3H家族基因在膀胱尿路上皮细胞癌组织中的表达及其预后意义

陈炎锋 何孝永

膀胱尿路上皮细胞癌（bladder urothelial carcinoma，BLCA）是最常见的恶性肿瘤之一，具有较高的复发率和死亡率[1]。目前虽有大量研究对BLCA的发生、发展和转移机制等作了探讨，但是对BLCA的分子特征仍然未知。笔者认为，筛选鉴定BLCA相关肿瘤标志物并探究相关机制，将有助于发现新的治疗方案。脯氨酰3-羟化酶（prolyl 3-hydroxylase，P3H）主要包括 P3H1、P3H2、P3H3、P3H4、CRTAP，其中P3H4已被证实与泌尿系肿瘤相关[2]。目前关于不同P3H家族基因在BLCA的发生、发展中的具体作用尚未知晓。因此，本研究对不同P3H家族基因在BLCA组织中的表达及其预后意义作一探讨，以期为BLCA的临床诊治提供参考。

1 对象和方法

1.1 对象 从癌症基因组图谱数据库（https://portal.gdc.cancer.gov/）和GTEx数据库获取435例BLCA患者的临床数据，其中男309例，女126例；年龄69（60，77）岁；肿瘤TNM分期：Ⅰ期25例，Ⅱ期130例，Ⅲ期142例，Ⅳ期138例。

1.2 数据获取 （1）BLCA与癌旁正常组织中P3H家族基因表达水平的数据：使用UCSC XENA（https://xenabrowser.net/datapages/）经Toil流程统一处理的TPM格式的RNAseq数据并进行log2转化后获得。（2）临床相关性及预后分析数据：将数据库中HTSeq-FPKM格式的RNAseq数据转换成TPM格式，并进行log2转化后获得。

1.3 统计学处理 采用R 3.6.3统计软件。不符合正态分布的计量资料组间比较采用Kruskal-Wallis H检验。以P3H家族基因表达水平的中位数为分界点分为高、低表达组，绘制Kaplan-Meier生存曲线并采用log-rank检验比较两组总体生存率。绘制ROC曲线分析P3H家族基因表达水平预测患者预后的效能，AUC为0.5～＜0.7提示有较低的准确度，0.7～0.9提示有一定的准确度，＞0.9提示有较高的准确度。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BLCA与癌旁正常组织中P3H家族基因表达水平比较 与癌旁正常组织比较，P3H1、P3H4在BLCA组织中的表达水平均明显升高，P3H2、P3H3、CRTAP在BLCA组织中的表达水平均明显降低，差异均有统计学意义（均 P＜0.05），见图 1（插页）。

图1 膀胱尿路上皮细胞癌（BLCA）与癌旁正常组织中脯氨酰3-羟化酶（P3H）家族基因表达水平比较（*P＜0.05）

2.2 不同TNM分期的BLCA患者P3H家族基因表达水平比较 不同TNM分期的BLCA患者P3H1、P3H3、P3H4、CRTAP表达水平比较，差异均有统计学意义（均P＜0.05），其中Ⅰ期和Ⅱ期患者的P3H3、P3H4表达水平较Ⅲ、Ⅳ期患者明显降低（均P＜0.05），Ⅱ期患者的P3H1、CRTAP表达水平较Ⅲ、Ⅳ期患者明显降低（均P＜0.05）；不同TNM分期的BLCA患者P3H2表达水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见图2（插页）。

图2 不同TNM分期的膀胱尿路上皮细胞癌（BLCA）患者脯氨酰3-羟化酶（P3H）家族基因表达水平比较（*P＜0.05，△P＞0.05）

2.3 P3H家族基因表达水平与BLCA患者预后的关系及预测效能分析 Kaplan-Meier生存分析显示，P3H1、P3H3、P3H4、CRTAP基因表达水平与BLCA患者的预后有关，高表达组总体生存率更低（均P＜0.05）；而P3H2基因表达水平与BLCA患者的预后无关，差异无统计学意义（P＞0.05），见图 3。ROC曲线分析显示，P3H1、P3H2、P3H3、P3H4、CRTAP预测BLCA患者的预后均有一定的准确度，但预测趋势方向不一致，其中P3H1、P3H4预测方向一致，而P3H2、P3H3、CRTAP预测方向一致。与P3H1（AUC=0.774）相比，P3H4（AUC=0.837）的预测效能更高；与 P3H3（AUC=0.643）和 P3H2（AUC=0.724）比较，CRTAP（AUC=0.825）的预测效能更高，见图 4。

图3 膀胱尿路上皮细胞癌（BLCA）患者脯氨酰 3- 羟化酶（P3H）家族基因高、低表达组的生存曲线（a：P3H1；b：P3H2；c：P3H3；d：P3H4；e：CRTAP）

图4 不同脯氨酰3-羟化酶（P3H）家族基因预测膀胱尿路上皮细胞癌（BLCA）患者预后的的ROC曲线（a：P3H1、P3H4；b：P3H2、P3H3、CRTAP）

3 讨论

既往研究表明，P3H家族基因及其突变与人类疾病有关，其根本原因主要与胶原蛋白改变有关[3]。目前已在人类基因组中鉴定出5种P3H家族蛋白，即P3H1、P3H2、P3H3、P3H4、CRTAP，均属于内质网驻留蛋白，其中P3H1、P3H2和P3H3均具有高度保守的2-酮戊二酸，抗坏血酸和Fe（Ⅱ）依赖性双加氧酶结构域，可以羟化特定脯氨酸残基；而P3H4、CRTAP（软骨相关的蛋白）缺少酶结构域，但与P3H其他家族基因的N端部分具有显著相似性[4]。尽管已明确P3H家族某些成员在BLCA中起关键作用[2，5]，但仍需要阐明P3H家族成员在BLCA中的不同作用。因此，本研究对不同P3H家族基因在BLCA中的表达及预后意义作一探讨。

本研究结果显示，P3H1、P3H4在BLCA组织中表达明显升高，而P3H2、P3H3、CRTAP在BLCA组织中的表达明显低于癌旁正常组织。对于不同TNM分期患者，BLCA 组织中 P3H1、P3H3、P3H4、CRTAP 表达存在明显差异，而预后分析显示P3H家族基因高表达与BLCA患者总体生存率较低有关；此外，P3H2与BLCA患者的TNM分期及生存预后均无关，原因可能是P3H2仅在胶原蛋白链组装、稳定性和交联中发挥关键作用[6]。本研究ROC曲线分析显示，不同P3H基因的预测趋势方向并不一致，这可能与其是促癌基因还是抑癌基因有关。P3H3、P3H2、CRTAP的预测趋势方向一致，其中CRTAP的预测效能更高。研究表明，CRTAP和P3H1在内质网中形成稳定的三聚体复合物脯氨酰3-羟基化复合物，该复合物还包含亲环蛋白B、脯氨酰顺反异构酶[7]，对于适当的胶原蛋白修饰和内质网中的折叠至关重要。而P3H3、P2H2同样是适当的胶原生物合成、折叠和组装所必需的，当编码P3H2的基因突变与至少2个不同家族中的隐性严重近视有关，并可能影响眼睛的胶原蛋白修饰[8-9]。此外，P3H2、P3H3、CRTAP 基因的表观失活与肿瘤的发生有关，这表明它可能作为肿瘤抑制因子发挥作用，但具体机制仍未知[3]。此外，P3H1与P3H4的预测趋势方向一致，其中P3H4的预测效能更高；这与Hao等[10]研究结果相似。Chen等[2]研究发现，升高的TPST1或P3H4表达与总体生存率较低、肿瘤病理分期较高等显著相关。P3H4不仅在BLAC组织中高表达，且具有较高的临床预后及肿瘤预测价值。P3H4最初被鉴定为与缔合复合体（SC）相关的蛋白质[4]，参与多种生理过程，如内质网中纤维状胶蛋白翻译后修饰，与P3H3形成稳定的复合物，可催化胶原蛋白α链中赖氨酸残基的羟基化，与赖氨酰羟化酶1和亲环蛋白B相互作用来调节骨量稳态和皮肤脆弱性[11-12]。此外，P3H4还可以作为衔接蛋白，连接髓磷脂蛋白零（P0）及活化的蛋白激酶C受体），从而降低P0的磷酸化和黏附功能，诱发遗传性周围神经病变[13]。随后研究发现，P3H4与间质性膀胱炎、膜性肾病、前列腺癌等疾病相关的自身抗原有关，而泌尿系统的自身免疫性破坏在BLCA发病机制中至关重要[2，4]。

综上所述，在BLCA的发生、发展过程中，P3H2、P3H3、CRTAP可能作为抑癌基因而P3H1、P3H4可能作为促癌基因发挥作用，其中P3H4对BLCA患者预后的预测价值较高。但本研究也存在一定的局限性，如所有数据来自数据库、未评估P3H家族基因在BLCA中的潜在诊断及治疗作用等。