铁盐处理下马铃薯NAC转录因子相对表达量时空差异分析

曲自成，唐鑫华，孙 宇，任智新，彭 露，石 瑛

(东北农业大学农学院，黑龙江 哈尔滨 150030)

【研究意义】马铃薯是全球四大主粮作物之一，块茎可作为主粮及饲料，又有一定药用价值，具有健胃，解毒，消肿的功效[1]。世界上大约有2/3 的人口以马铃薯作为主粮，马铃薯的高产、稳产对于保障世界粮食安全有重要作用[2]。铁元素为植物生长发育所必需，是合成叶绿素的必要组分、参与植物光合作用、呼吸作用以及胞内的氧化还原反应、电子传递[9]。虽然在土壤中铁元素含量较高，但在中性和碱性土壤中多以不溶的Fe3+的形式存在，无法被植物吸收利用，使得植物可能无法获得足够的铁元素以维持生命活动[3]。据统计全球盐碱地面积为 9.54 ×108hm2，并且以每年 1.0×106hm2的速度在增长，其中中国盐碱地面积为9.913×107hm2，涉及19个省份，其中包括马铃薯主产区松嫩平原[4]。现马铃薯产业的发展因盐碱地区铁元素失调严重受限，相关研究需要进一步完善，因此，培育和筛选高效吸收、利用铁元素的马铃薯品种，对于提高马铃薯产量起着重要作用。其中，深入研究作物响应铁盐胁迫的机理及筛选响应铁盐胁迫的相关基因是解决因作物铁素失调导致作物减产甚至绝产的有效途径之一。本试验以马铃薯作物为试验材料，筛选得到高效响应铁盐胁迫的马铃薯NAC转录因子，并分析其时空表达特性，可为马铃薯耐铁盐胁迫相关分子育种及NAC转录因子家族的深入研究提供理论依据。【前人研究进展】NAC (NAM， ATAF和CUC)是植物特有的转录因子大家族，调控着植物生长、发育、衰老相关的多个过程[5]，小麦中TaNAC67转录因子参与调控穗长和每穗小穗数[6]。NAC转录因子与植物应激反应相关，一些NAC基因为生物、非生物胁迫所诱导[7]，如VND7基因在拟南芥中有调节干旱胁迫的作用[8]，盐芥中TsNAC1基因调控盐胁迫响应[9]。Huang[10]等在番茄中发现了对番茄黄叶卷曲病毒感染有反应的6种NAC转录因子，这些转录因子还与蛋白磷酸酶和丝裂原活化蛋白激酶以及转录因子有相互作用。NAC转录因子具有显著的结构特点，即蛋白的N端都有一个高度保守的约150个氨基酸组成的NAC结构域，含有 A、B、C、D、E 5个亚结构域，其中亚域 C 可能与结合 DNA 有关，亚域 E 可能参与发育时期调控和(或)组织特异性，并协同亚域D 与 DNA 发生相互作用[11]。转录因子不仅仅可以通过转录激活功能调控基因的表达，直接调节植物对胁迫环境的耐受能力，还可以通过在各种生化代谢途径中发挥调节因子的作用从而调控植物的胁迫耐受力。如何健美[12]等对水稻中OsNAC2基因的研究表明，OsNAC2可能同时参与 IAA与GA的代谢途径，调节根的生长发育，从而影响植物的抗旱性。杨丽丽以马铃薯品种大西洋无菌试管苗为试验材料研究发现缺Fe2+胁迫会导致马铃薯叶片叶绿素含量显著降低，结合差异蛋白质组分析马铃薯在缺Fe2+胁迫下的叶片差异蛋白，共发现146个差异蛋白质。这些蛋白质功能涉及光合作用、代谢、细胞防御、氧化还原、骨架蛋白、转录翻译、生长素响应等多种功能范畴[13]。王玉萍以马铃薯品种大西洋无菌试管苗为试验材料研究发现缺Fe2+影响碳水化合物代谢和根系建成,造成马铃薯总根长度减少但平均直径增加[14]。NAC转录因子家族在植物响应逆境胁迫时起重要作用，但有关马铃薯响应铁盐胁迫的研究及报道较少。【本研究切入点】本研究通过转录组测序并结合qRT-PCR技术、生物信息学分析，对马铃薯NAC转录因子在铁盐胁迫下的转录水平及时空差异进行分析，明确其在铁盐胁迫下的表达特性。本研究将明确马铃薯NAC转录因子参与响应铁盐(Fe2+)胁迫的表达模式及特性。【拟解决的问题】研究结果为马铃薯耐铁盐胁迫相关分子育种及NAC转录因子家族深入研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 马铃薯组培苗培育条件及处理方法

试验使用继代后生长20 d的马铃薯品种东农312组培苗，培养箱内温度23 ℃，16 h光照，8 h黑暗。分别用Fe2+为 1 μmol/L(缺铁处理)、100 μmol/L(对照)和500 μmol/L(过量铁处理)的MS培养液处理组培苗0、48、96 h，处理后培养条件与上述一致。以100 μmol/L Fe2+处理组为对照，在处理0、48、96 h时取叶、茎、根鲜样，液氮速冻后保存于-80 ℃冰箱备用，试验设置3次重复。

1.2 总RNA的提取及cDNA链的合成

RNA提取方法参照Tang[15]，使用康为公司(HiFiScript gDNA Removal cDNA Synthesis Kit)反转录试剂盒合成单链cDNA。

1.3 实时定量PCR引物的设计

基于前期马铃薯品种东农312转录组测序结果，共获得7个差异表达的NAC转录因子，应用Primer5.0软件设计实时定量PCR引物(表1)。

1.4 实时定量PCR检测

实时定量PCR试验以ef1α(内参基因)表达量作为对照。根据(ULtraSYBR Mixture)试剂盒(康为公司，北京)说明书配置反应体系，反应体系含cDNA 2 μL，正、反引物各0.5 μL，2 × UltraSYBR Mixture 10 μL，ddH2O 7 μL，总体积20 μL。反应程序为预变性95 ℃10 min，95 ℃变性10 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸32 s，共40个循环。在(型号Line Gene 9620)实时定量PCR仪上检测内参及目的基因表达量。采用2-△△Ct算法分析实验结果，其中，△△Ct=[(CT处理-CT内参) - (CT对照-CT内参)]。每个处理设置3个重复。

表1 实时定量PCR引物的设计

1.5 数据统计分析

应用SPSS 23.0对实时定量PCR数据进行统计分析，Graphpad 7软件绘图。

1.6 生物信息学分析

利用Expasy提供的在线工具 Protparam(https://web.expasy.org/protparam/ )对NAC1-7基因编码蛋白质序列进行分子量、理论等电点、等理化性质的分析。利用SMART在线工具(http://smart.embl-heidelberg.de/)进行蛋白结构域分析。

2 结果与分析

2.1 缺铁盐处理下7个基因相对表达量分析

在根部，除NAC6、NAC2以外，其它NAC基因在缺铁处理48 h时表达量显著下调。NAC2、NAC5、NAC6、NAC7在缺铁处理96 h时表达量显著上调，分别为CK组的27.3、7.3、8.9、4.53倍，NAC2、NAC5、NAC7在这两个时间节点的表达量随着胁迫时间的增加呈先下调后上调的趋势。NAC1、NAC3、NAC4在缺铁处理48、96 h时表达量均显著低于CK组。受缺铁诱导表达量变化最显著的是NAC2，在缺铁处理48、96 h的表达量分别为CK组的0.7、27.3倍(图1)。在茎中，除NAC2外，其它NAC基因在缺铁处理48 h时的表达量均显著上调，为CK组的2.4～11.2倍。NAC3、NAC5、NAC6、NAC7在缺铁处理96 h的表达量均显著低于CK。NAC1、NAC4在两个时间节点的表达量较CK组均显著上调(图2)。在叶中，所有NAC基因在缺铁处理48、96 h时的表达量均低于CK组(图3)。

2.2 过量铁盐处理下7个基因相对表达量分析

在根部，NAC2、NAC5在处理48 h的表达量较CK组显著上调，NAC1、NAC4的表达量较CK组显著下调。NAC1、NAC2、NAC6、NAC7在处理96 h时的表达量显著上调，为CK组的5.2～24.9倍。NAC2在处理48、96 h时的表达量均显著高于CK组，分别为CK组的4.1、24.9倍(图4)。在茎中，除NAC2、NAC5、NAC7外，其它NAC基因在处理48 h的表达量较CK组均显著上调且为最高值。处理至96 h时，NAC3、NAC6的表达量较CK组显著下调，在两个时间节点呈先上调后下调的趋势。NAC1、NAC4在两个时间节点表达量较CK组均显著上调。NAC7在两个时间节点表达量较CK组均显著下调，在处理48 h的表达量仅为CK组的8%。NAC5在两个处理时间点的表达量较CK组均无显著变化(<对照组两倍，图5)。在叶中，除NAC7在处理96 h时表达量与CK组无显著差异外，所有NAC基因在两个时间节点表达量均显著低于CK组(图6)。

2.3 NAC1～NAC7 编码蛋白的生物信息学分析

NAC1～NAC7的ORF编码蛋白含有192～413个氨基酸，预测分子量为22.81～46.98 kDa，PI值为4.65～9.23(表2)。NAC1～NAC7的ORF所编码蛋白均含有NAM结构域。

3 讨 论

马铃薯组培所用的标准MS培养基Fe2+浓度为100 μmol/L[16]，因此本试验选用Fe2+浓度为100 μmol/L的MS作为对照，并以该Fe2+浓度做为参考设置两个处理(缺铁1 μmol/L和过量铁500 μmol/L)。在缺铁处理下，NAC1～NAC7的表达呈现出明显的时空特异性，在茎、根中均有显著表达，在叶中的表达量显著低于根、茎部，所述表达差异可能是由基因表达的组织特异性导致，如拟南芥中响应低铁盐胁迫的8个基因的表达具有明显的组织特异性，AtFRO2和AtFRO3在根中，AtFRO5和AtFRO6主要在芽和花，而AtFRO7在叶片的表皮毛和子叶中，AtFRO8在叶脉中表达[17]。NAC3、NAC4在茎中表达量显著上调，但在根、叶中的表达量均显著低于对照组，推断得出它们在茎中特异表达，响应缺铁胁迫。

表2 7个NAC蛋白的特征

表3 7个NAC蛋白的结构域分析

植物根部负责有机营养和矿质元素的吸收的吸收，在铁盐胁迫下，根系会做出一系列反应进行应对。如紫花苜蓿在缺铁条件下，根系会显著增长，须根也会显著增多以增加铁元素的吸收[18]。云香水仙NtNAC1基因在NaCl胁迫下，同一处理时间点在根中的表达量上调大于叶。本试验中NAC2在缺铁、过量铁胁迫下，在根中表达量上调最为显著，与云香水仙NtNAC1基因响应非生物逆境胁迫表达模式一致[19]。马铃薯属双子叶草本植物，通过机理I吸收铁元素。该机理包括3个过程①H+-ATPase泵系统， 分泌H+降低土壤pH值， 增加根际土壤颗粒中铁的可溶性；②Fe3+还原系统， 包括将Fe3+还原成Fe2+的还原酶和与之耦联的NADPH脱氢酶；③Fe2+的转运系统，包括一系列的铁转运蛋白，将还原的亚铁离子转运到细胞内， 再由其它转运蛋白输送到各个细胞器和器官中供利用[20]。NAC2在缺铁、过量铁胁迫下的马铃薯植株的茎、根部位均强烈表达，随缺铁和过量铁处理时间的增加其在根部的表达量呈现显著增加趋势，且表达量变化最为显著，与铁毒耐受性水稻珍汕97 B中OSIR1基因主要表达部位及趋势一致[21]，同时也有研究指出OSIR1基因也受缺铁胁迫诱导表达[22]。推测NAC2表达模式与OSIR1类似，在响应缺铁和过量铁胁迫中起重要作用。

4 结 论

本试验应用qRT-PCR技术并结合实验室前期转录组测序数据发现马铃薯NAC转录因子参与响应铁盐胁迫；在缺铁和过量铁胁迫下，NAC1～NAC7存在组织特异性表达，且表达量随处理时间的增加变化显著，在根和茎中均呈现显著差异表达，在叶中无显著上调表达；生物信息学分析表明NAC1～NAC7编码蛋白含有192～413个氨基酸，预测分子量为22.81～46.98 kDa，PI值为4.65～9.23，均含有NAM结构域。