基于网络药理学分析当归-白芍药对治疗腰椎间盘退变的潜在靶点及机制

徐彬 丁伟国 盛红枫 徐卫星*

腰腿疼痛是成年人最常见的不适症状［1］，而椎间盘退变（intervertebral disc degeneration，IDD）是导致腰腿疼痛的最常见原因之一［2］。年龄、基因、营养、代谢、感染、生物力学等诸多因素都与IDD 发病相关，但确切的发病机制尚不明确。目前，主要的治疗手段有保守治疗、介入治疗、手术治疗，既不能延缓椎间盘的退变进程，也不能对退变椎间盘进行再生修复。IDD 可归属中医“腰腿痛”范畴，认为其由肝肾亏虚、血瘀气弱引起［3］，治以补肝益肾、活血通经为主，当归、白芍是常用药物，此药对源自《仙授理伤续断秘方》治疗外伤瘀血作痛之主方四物汤，也常常出现在独活寄生汤等治疗骨伤疾病的经方中。研究表明，中药治疗腰椎间盘退变是通过多种功效的不同活性成分作用于多个环节或信号通路及靶点而产生治疗效果。当归-白芍药对治疗腰椎间盘退变仍处于初级阶段，作用机制中涉及的活性成分、治疗靶点及信号通路仍不完全清楚。本研究基于网络药理学理论系统、科学的探究当归-白芍药对治疗腰椎间盘退变的作用靶点及机制。

1 研究方法

1.1 当归-白芍的活性成分及作用靶点筛选 在中药系统药理学数据库与分析平台（Traditional Chinese Medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）数据库中分别以“当归”“白芍”为检索词，检索其活性成分，设定口服生物利用度（OB）≥30%、类药性（DL）≥0.18 进行筛选。使用Pubchem数据库获得上述成分的SDF 结构，导入Swiss Target Prediction 数据库，取预测得分大于0 的靶标作为药物靶点。

1.2 疾病相关靶点的筛选 使用OMIM、Disgenet、Genecards 数 据 库 以“intervertebral disc degeneration”“lumbar intervertebral disc degeneration”为关键词进行检索，获得疾病相关靶点。

1.3 当归-白芍治疗治疗腰椎间盘退变关键靶点筛选 在Venny2.1 在线软件作图工具平台上输入筛选出的当归-白芍药对作用靶点及腰椎间盘退变关键靶点，绘制韦恩图，两者取交集后获得药物-疾病共同靶点。1.4 中药-成分-靶点-疾病网络构建及分析 将筛选出的关键靶点和药物活性成分信息编辑成“药物-成分”“成分-靶点”“疾病-靶点”关系文件和属性文件，使用Cytoscape 3.7.2 软件，构建“药物-成分-靶点-疾病” 网络图。节点为当归、白芍、药物活性成分、关键靶点及腰椎间盘退变，边为当归、白芍与对应活性成分、活性成分与靶点、腰椎间盘退变与靶点的相互作用关系。

1.5 PPI 网络构建及核心靶点分析 将上述药物-疾病共同靶点输入至STRING 数据库中进行检索，设置蛋白种类为“Homo sapiens”，最低相互作用阈值为0.4，构建蛋白相互作用的PPI 网络图。

1.6 核心靶点筛选 将PPI 网络导入Cystoscap 3.7.2中，通过Network Analyzer 工具进行拓扑分析，以degree，betweenness centrality，average shortest path length 和closeness centrality 四个参数为参考标准，通过degree 排序，选取分值大于平均分的基因作为核心靶点，将前30 个靶点使用R 3.6.1 绘制条形图。使用MCODE 模块进行基因簇的分析以及核心靶点的筛选。

1.7 核心靶点基因功能和通路富集分析 基于R 软件使用Bioconductor 生物信息软件包以P value＜0.05，Q value＜0.05 进行关键靶基因GO 功能富集分析与KEGG通路富集分析，并将结果以条形图和气泡图形式输出。

2 结果

2.1 当归-白芍的活性成分及作用靶点筛选 在TCMSP 数据库中设定OB ≥30%、DL ≥0.18，对当归、白芍的有效成分进行筛选。共得到潜在活性成分14 个，其中当归2 个，白芍13 个，包括豆甾醇、谷甾醇、β-谷甾醇、丁子香萜、山奈酚、（+）-儿茶素、芍药苷元、芍药新苷、芍药苷、芍药苷_qt、芍药内酯苷_qt、苯甲酰芍药苷，活性成分β-谷甾醇为两者共有，见表1。使用Swiss Target Prediction 数据库筛选出342 个药物靶点，其中当归43 个，白芍342 个。

表1 当归-白芍的活性成分

2.2 当归-白芍治疗治疗腰椎间盘退变的关键靶点筛选 在OMIM、Disgenet、Genecards 数据库进行检索，去重后共获得腰椎间盘退变靶点1110 个。在Venny2.1在线软件作图工具平台上输入342 个药物靶点、1110个疾病靶点，绘制韦恩图，两者取交集后获得药物-疾病共同靶点69 个。见图1。

图1 当归-白芍治疗腰椎间盘退变的关键靶点韦恩图

2.3 中药-成分-靶点-疾病网络构建及分析 将白芍-当归中14 个潜在活性成分与69 个药物-疾病共同靶点输入Cytoscape 软件中，删除与靶点无交集的孤立成分，绘制出“药物-成分-靶点-疾病”相互作用的网络图（见图2），发现当归-白芍有13 种活性成分，1 个活性成分靶点与疾病靶点无交集，予删除，为（+）-儿茶素。

图2 当归-白芍治疗腰椎间盘退变的药物-成分-靶点-疾病相互作用网络图

2.4 PPI 网络构建及核心靶点分析 构建蛋白相互作用的PPI 网络图，包括69 个节点，643 条边，见图3。通过degree 排序，将前30 个靶点使用R 3.6.1 绘制条形图（见图4），前10 名包括AKT1、EGFR、VEGFA、CASP3、CXCL8、MAPK8、CCND1、JUN、FGF2、MAPK14。使用MCODE 模块进行基因簇的分析以及核心靶点的筛选。总共得到3 个基因簇和2 个核心基因，核心基因为JUN、CCR1。

图3 当归-白芍治疗腰椎间盘退变蛋白相互作用PPI图

图4 当归-白芍治疗腰椎间盘退变的核心靶点

2.5 核心靶点基因功能和通路富集分析 将69个共同靶点经R 语言运行后GO 分析分子功能。GO 功能富集分析共确定79 个与分子生物功能相关的条目，主要有内肽酶活力、金属内肽酶活性、1-磷脂酰肌醇-3-激酶活性、磷脂酰肌醇3-激酶活性、磷脂酰肌醇磷酸激酶活性、金属肽酶活性、跨膜受体蛋白激酶活性、蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶活性、生长因子结合、蛋白磷酸酶结合、类固醇激素受体活性、丝氨酸型内肽酶活性、丝氨酸肽酶活性、磷酸酶结合、丝氨酸水解酶活性、胰岛素受体底物结合、细胞因子受体结合、参与凋亡过程的半胱氨酸型内肽酶活性、核受体活性，见图5。将69 个共同靶点经R 语言运行后共得到134 条KEGG 通路，前20 的结果形成KEGG 功能富集的条形图（见图6），包括TNF 信号通路、IL-17 信号通路、HIF-1 信号通路、雌激素信号通路、细胞凋亡。

图5 当归-白芍治疗腰椎间盘退变的GO功能富集分析结果

图6 当归-白芍治疗腰椎间盘退变的KEGG富集分析

3 讨论

临床上，众多补益肝肾、活血通经的中药被用于治疗腰椎间盘退变导致的腰腿痛。通过数据挖掘分析中医医案古籍腰痛症用药规律，发现高频用药中包括当归和白芍［4］。林浩等［5］采用含有当归和白芍的当归四逆汤治疗腰椎间盘突出症，发现其可降低组胺、5-羟色胺、白细胞介素6、白细胞介素1β 水平，缓解腰部疼痛、改善腰椎功能。王浩平等［6］治疗腰椎间盘突出，在实施椎间孔镜的基础上应用含有当归与白芍的独活寄生汤，发现独活寄生汤可以进一步缓解疼痛，提高疗效。王晓东［7］采用独活寄生汤治疗椎间盘源性腰痛亦取得良好疗效。

本研究采用网络药理学的方法分析当归-白芍此药对治疗腰椎间盘退变的分子生物学机制，发现在当归-白芍此药对中起治疗作用的活性成分包括β-谷甾醇、山奈酚、芍药苷、豆甾醇、谷甾醇等。芍药苷，可以抑制FasL 表达，进而抑制IL-6 及TNF-α 等炎性因子的分泌，最终起到抑制髓核细胞凋亡的作用［8］；对椎间盘纤维环细胞具有明显的促增殖作用，Fas 配体诱导椎间盘纤维环细胞有保护作用［9］；可有效抑制纤维环细胞炎症模型IL-1β、IL-6 和TNF-a 的表达［10］。β-谷甾醇，具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗衰老、保护肝肾功能以及调节免疫系统、骨代谢的作用［11］。山奈酚，可以降低IL-1β、IL-18、Caspase-1、Caspase-3、Caspase-9、NLRP3 等炎症因子及促炎因子的表达，具有抗炎、抗氧化、抗菌等药理作用，同时可以抑制大鼠蛋白尿、血肌酐和尿素氮含量，起到保护肾脏组织及功能的作用［12］。ZHU 等［13］研究发现，山奈酚可通过抵消脂多糖诱导的细胞凋亡并增加细胞增殖来增强细胞活力；还可提高SOX-9、胶原II 和蛋白聚糖等软骨生成标志物的水平，降低基质降解酶的水平，提示其具有成骨作用；可通过降低促炎细胞因子的水平和通过抑制核转录因子的核易位而增加抗炎细胞因子来减轻炎症。因此，笔者推测当归-白芍药对可能是通过抑制炎症、抑制细胞凋亡、调节免疫、调节骨代谢、保护肝肾等作用治疗腰椎间盘退变。

当归-白芍药对与腰椎间盘退变，药物-疾病共同靶点有69 个，包括AKT1、EGFR、VEGFA、CASP3、CXCL8、MAPK8、CCND1、JUN、FGF2、MAPK14 等。69 个共同靶点经过GO 功能富集分析后，发现与之相关的的分子生物功能包括内肽酶活力、金属内肽酶活性、1-磷脂酰肌醇-3-激酶活性、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）活性、磷脂酰肌醇磷酸激酶活性等。PI3K 参与细胞增殖、分化、凋亡等多种细胞功能的调节，VEGFA、FGF 等多种生长因子都能启动PI3K 的激活。AKT 是PI3K 下游主要的效应物，亦称蛋白激酶B（PKB），可通过磷酸化多种酶、激酶和转录因子等下游因子，参与多种细胞功能的调节［14］。研究表明，PI3K/AKT 信号通路的激活可增加细胞外基质的含量，预防细胞凋亡，促进细胞增殖，调节细胞自噬，减轻氧化损伤以及适应低氧微环境，起到保护椎间盘的作用［15］。HUANG等［16］发现，椎间盘退变患者的髓核细胞中EGFR 表达更高，且与退变的程度成正比，此外EGFR 激活的Akt/GSK3 信号通路可促进CXCL8 的表达。CXCL8 在退变椎间盘髓核细胞中表达增高，并在腰椎间盘退变的进程中扮演了重要作用［17］，还与腰椎间盘突出引起的神经根性疼痛有关［18］。CASP3 是细胞凋亡途径中最为关键的酶之一，与椎间盘退变的发表的机制有着密切的联系［19］。PI3K/Akt/mTOR/caspase-3 信号通路与PI3K/Akt/GSK3β/caspase-3 信号通路均参与了利拉鲁肽抵抗激素导致髓核细胞凋亡，起到保护椎间盘的作用［20］。HIF-1 是缺氧反应的重要调节因子，分为HIF-1α 和HIF-1β［21］，其中HIF-1α 通过调节细胞凋亡、线粒体凋亡等途径参与椎间盘退变的发生［22］。此外，笔者发现TNF 信号通路、IL-17 信号通路、雌激素信号通路等也可能参与当归-白芍药对治疗腰椎间盘退变的作用机制，而这些信号通路与抑制炎症、抑制细胞凋亡、调节免疫密切相关。

综上所述，当归-白芍对腰椎间盘退变可能起到治疗效果的活性成分包括包括β-谷甾醇、山奈酚、芍药苷等，可能通过AKT1、EGFR、VEGFA、CASP3、CXCL8 等靶点及TNF、IL-17、HIF-1 等信号通路发挥治疗作用，为进一步研究当归-白芍治疗腰椎间盘退变的作用机制奠定了基础。