知母-黄柏配伍抗炎作用机制的网络药理学研究

潘会君，朱全刚，朱聪聪

(1.上海市皮肤病医院，上海 200443；2.同济大学附属皮肤病医院，上海 200443)

知母-黄柏配伍是临床上常用的药对，广泛用于实热证和虚热证的治疗，如知柏地黄丸、滋肾通关丸等经典方均含有知母-黄柏药对。已有的研究显示，知母-黄柏药对盐炙前后对糖皮质激素致肾阴虚大鼠具有滋阴清热作用[1]；知母提取物及黄柏提取物具有降糖作用，对糖尿病模型小鼠的周围神经病变有保护作用[2]；能提升胰岛素敏感性，促进糖脂代谢[3]。知母-黄柏药对可能通过调节PI3K/Akt通路而实现对Ⅱ型糖尿病大鼠认知功能障碍的改善[4]。

随着高通量组学、生物信息学、计算机科学等多种学科的交叉，国内外学者开始将视角转向复杂网络，网络药理学应运而生[5]。越来越多的中药配伍研究采用网络药理学进行分子机制、作用靶点、毒性研究等。通过网络药理学分析，知母-黄柏药对影响糖尿病胰岛素抵抗、胰岛素信号通路、胰高血糖素信号通路、炎症通路和Ⅰ、Ⅱ型糖尿病通路[6]，并对精神分裂症、糖尿病、 阿尔茨海默症、非特异性癌症、哮喘、前列腺肿瘤、乳腺肿瘤、肥胖、心血管疾病等具有潜在的作用[7]。

炎症是机体防御感染及修复损伤的保护性反应，在机体自稳中发挥着重要的调节作用，过度的炎症反应会对机体造成损害，引起器官的组织和细胞发生变性坏死，并且有可造成严重后果[8]。因此，抗炎药物对于解决炎症性疾病具有重要作用。临床上非甾体类抗炎药是临床使用最广泛的消炎、镇痛药物之一，近年来生物制剂(TNF-α 拮抗剂、IL-17 拮抗剂、IL-12 /23 拮抗剂、IL-23 拮抗剂)也广泛用于炎症性疾病的治疗，如肿瘤、关节炎、银屑病、特应性皮炎等。

已有的研究显示，知母-黄柏药对具有抗炎作用，其抗炎作用与NF-κB信号通路相关[9]。知母-黄柏药对属于中药“相须”配伍，其相须配伍的抗炎作用机制尚未阐释清楚。因此，本研究采用网络药理学方法对知母-黄柏“相须”配伍的协同抗炎作用进行解析，从而丰富知母-黄柏药对的协同抗炎作用，为其治疗炎症性疾病提供依据。

1 方法

1.1 成分收集、筛选及靶点预测

从中药系统药理学数据库与分析平台(traditional chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)(https://tcmspw.com/tcmsp.php)获取化学成分，根据口服生物利用度(Oral bioavailability，OB)≥20%及类药性(drug-likeness，DL)≥0.1进行筛选[10]。从中医药百科全书数据库(an encyclopedia of traditional chinese medicine ，ETCM)(http://www.tcmip.cn/ETCM/index.php/Home/Index/index.html)收集知母和黄柏的化学成分，根据药物相似程度权重值(druglikeness weight，DW)≥0.49筛选化学成分[11]。通过ETCM、TCMSP收集的所有靶点进行合并去重，统一在UniProt上校正，转换成homo sapiens的Official Gene Symbol。

1.2 炎症相关靶点的获取

通过 OMIM(online mendelian inheritance in man)数据库(https://omim.org/)[12], Phenopedia数据库 (https:// phgkb.cdc.gov/PHGKB/startPagePhenoPedia.action)[13]，以“inflammation”为关键词进行捜索，收集靶点，去除重复，获得炎症相关靶点。

1.3 筛选知母-黄柏药对抗炎靶点

通过Venny 2.1(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)[14]将筛选得到的中药靶点映射到炎症靶点，得到知母-黄柏药对的潜在抗炎靶点。

1.4 知母-黄柏药对抗炎靶点网络的构建

利用Cytoscape 3.7.2软件构建知母和黄柏中药-成分-靶点网络，并使用Network Analyzer插件分析网络节点的拓扑性质参数，确定靶点的受调控分[15]，从而确定靶点被中药调控的强度。网络节点的拓扑性质参数，包括度(degree)、介数中心度(betweenness)及接近中心性(closeness)[16]。研究认为，一个点的度值为该网络度中位数的2倍或以上则定义为核心成分和靶点[17]。

1.5 GO及KEGG富集分析

利用DAVID(the database for annotation, visualization and integrated discovery)v6.8(https://david.ncifcrf.gov/)[18]在线分析工具对知母-黄柏药对的潜在抗炎靶点进行基因本体(gene ontology,GO)分析及京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG) 通路富集。使用OmicStudio tools(https:// www.omicstudio.cn/tool)对富集结果进行气泡图绘制。

1.6 中药-成分-抗炎靶点-信号通路的网络构建及分析

使用OmicStudio tools绘制中药-成分-抗炎靶点-信号通路桑基图。

2 结果

2.1 知母-黄柏药对的成分及靶点

通过 TCMSP和ETCM 数据库共获得知母化学成分25个，黄柏化学成分42个，知母、黄柏共有成分1个，为Stigmasterol(图1)；知母化学成分对应靶点141个，黄柏化学成分对应靶点250个，知母、黄柏共有靶点113个(图1)。知母、黄柏共有成分、共有靶点从一定程度上为知母-黄柏的“相须”配伍提供了物质基础及分子基础。

图1 知母-黄柏药对化学成分及靶点维恩图Fig.1 Venn diagram of the chemical constituents and targets of Anemarrhenae Rhizoma-Rhellodendri Chinensis Cortex

通过构建知母-黄柏-成分-靶点网络(图2)，发现存在单一成分作用在多个靶点的现象，同一靶点与多种成分相关,符合中药多成分、多靶点相互作用的特征，知母-黄柏多种成分参与对共有靶点调控，为其“相须”配伍提供了分子靶点基础。

图2 知母-黄柏药对化学成分-靶点网络图Fig.2 Network diagram of the chemical constituents and targets of Anemarrhenae Rhizoma-Rhellodendri Chinensis Cortex

2.2 炎症靶点库的构建

通过OMIM,Phenopedia数据库，以“inflammation”为关键词进行检索，收集靶点，去除重复，获得炎症相关靶点2597个(图3)。

2.3 知母-黄柏药对对炎症靶点的调控作用

为研究知母-黄柏药对靶点与炎症靶点的关系，本研究将知母靶点、黄柏靶点映射到炎症靶点，结果发现，91个知母靶点与炎症靶点重叠，168个黄柏靶点与炎症靶点重叠，182个知母-黄柏药对靶点与炎症靶点重叠，这些靶点定义为潜在抗炎靶点。其中77个靶点为知母、黄柏、炎症共有(图3)，共有靶点为知母-黄柏药对“相须”抗炎作用提供了直接作用分子靶点。

图3 知母-黄柏靶点与炎症靶点的维恩图Fig.3 Venn diagram of the targets of Anemarrhenae Rhizoma-Rhellodendri Chinensis Cortex and inflammation

为了评价靶点被中药调控的强度，引入靶点的受调控分进行评价。靶点的受调控分为靶向此蛋白的中药-化合物组合的数量，例如，只有一个化合物靶向某靶点，但是此化合物包含在复方的3 味中药中，此靶点的受调控分为3；另一个靶点被2个化合物所靶向，其中一个化合物包含在2味中药中，另一个包含在另外3味中药中，这个靶点的受调控分就是5。受调控分高的靶点即为受复方作用更强的靶点。

通过分析知母-黄柏药对与炎症的潜在作用靶点网络图(图4)，发现其中不少靶点都具有较高的受调控分，其中知母靶点受调控分中位数为1，黄柏靶点受调控分中位数为2，知母-黄柏药对靶点受调控分中位数为4，知母-黄柏配伍后靶点受调控分明显增加，说明“相须”配伍具有分子靶点协同作用。知母-黄柏配伍后靶点受调控分≥8的靶点为29个，如PTGS2、PTGS1、RXRA、ADRB2、AR、CHRM1、ADRA1B、CHRM3、F10、NOS3等(表1)。

图4 中药-成分-靶点网络图Fig.4 Network diagram of TCM-constituents-targets

表1 靶点受调控得分

2.4 GO富集分析

对182个潜在抗炎靶点进行GO分析，根据P<0.01且错误发现率FDR(false discovery rate)<0.01得到GO条目301条。GO 富集分析分为3 类：生物过程(biological process,BP)、细胞组分(cell component,CC)和分子功能(molecular function,MF)。将GO条目按FDR从小到大排序后选取前20绘制BP、CC和MF的柱状图(图5)。

图5 知母-黄柏药对潜在抗炎靶点参与的生物过程、细胞组分、分子功能Fig.5 Biological process, cell component, and molecular function of potential anti-inflammatory targets of Anemarrhenae Rhizoma-Rhellodendri Chinensis Cortex

BP相关的条目最多，有235条，主要涉及RNA聚合酶II启动子转录的调控、药物反应、细胞增殖的正向调节、细胞凋亡的正向调节、一氧化氮生物合成的正向调节、细胞缺氧反应、细胞对脂多糖的反应、平滑肌细胞增殖的正向调节、炎症反应、ERK1和ERK2级联的正向调节、蛋白激酶B信号通路的正向调节、细胞迁移的正向调节、肿瘤坏死细胞因子反应等方面；CC相关的条目25条，主要涉及细胞质膜、胞质溶胶、内质网、核染色质、外泌体和线粒体等方面;MF相关的条目38 条，主要涉及蛋白结合、酶结合、转录因子结合、蛋白激酶结合、丝氨酸型内肽酶活性、类固醇激素受体活性、细胞因子活性、RNA聚合酶 Ⅱ 转录因子活性和血红素结合等方面。

2.5 KEGG 通路富集

对182个潜在抗炎靶点进行KEGG 通路富集，根据P<0.01得到106条KEGG通路，与癌症、炎症、慢性疾病、感染等相关。涉及癌症，如癌症通路、前列腺癌、胰腺癌、膀胱癌、癌症中的蛋白多糖、非小细胞肺癌、胶质瘤、慢性粒细胞白血病；信号转导，如TNF信号通路、HIF-1信号通路、PI3K-Akt信号通路、FOXO信号通路、VEGF信号通路；免疫系统，T细胞受体信号通路、Toll样受体信号通路；内分泌代谢性疾病，如胰岛素抵抗、 催乳激素信号通路等；病毒感染疾病，如乙型肝炎，甲型流感，丙型肝炎；信号分子及其相互作用，如神经活性配体-受体相互作用；细菌感染疾病，如查加斯病；寄生虫感染疾病，如弓形虫病；以及破骨细胞分化等。以上KEGG通路均与炎症密切相关，因此知母-黄柏药对调节炎症信号通路，发挥治疗炎症相关性疾病的作用。将KEGG通路按P<0.01 从小到大进行排序后选取排名前60的通路绘制气泡图(图6)。

图6 知母-黄柏药对潜在作用靶点富集的KEGG 通路Fig.6 KEGG pathway of the potential anti-inflammatory targets of Anemarrhenae Rhizoma-Rhellodendri Chinensis Cortex

2.6 知母-黄柏药对协同调控炎症信号通路

已有的研究显示，炎症与信号转导通路密切相关，为了更直接地理解知母-黄柏配伍对信号通路的协同作用，构建知母-黄柏药对中药-成分-靶点-通路桑基图(图7)。从图7中发现，知母-黄柏药对所含成分，靶点作用于多条信号转导通路，如TNF信号通路、HIF-1信号通路、PI3K-Akt信号通路、FOXO信号通路、VEGF信号通路、T细胞受体信号通路、Toll样受体信号通路；并且每条信号通路均有知母和黄柏相应的成分和靶点参与，两药协同调控炎症信号转导通路发挥抗炎的作用。知母和黄柏共同调节炎症相关分子靶点，如磷酸肌醇3激酶(PIK3CG)、前列腺素内过氧化物合酶2(PTGS2)、诱导型一氧化氮合酶(NOS2) 、内皮型一氧化氮合酶(NOS3)、毒蕈碱型胆碱受体M1(CHRM1)、毒蕈碱型胆碱受体M2(CNRM2)、类视黄醇X受体 alpha (RXRA)、转录因子AP-1 (JUN)、转录因子p65(RELA)、肿瘤坏死因子(TNF)等。因此，知母-黄柏药对“相须”作用的分子机制是通过多成分、多靶点调控共同信号通路发挥抗炎作用。

图7 知母-黄柏药对中药-成分-靶点-通路桑基图Fig.7 Sankey diagram of TCM-constituents-targets-pathways of Anemarrhenae Rhizoma-Rhellodendri Chinensis Cortex

3 讨论

本研究通过网络药理学方法对知母-黄柏药对的抗炎作用进行解析，结果发现182个知母-黄柏药对靶点与炎症靶点重叠，知母-黄柏配伍后靶点受调控分大于等于8的靶点为29个，如PTGS2、PTGS1、RXRA、ADRB2、AR、CHRM1、ADRA1B、CHRM3、F10、NOS3等；知母-黄柏药对所含成分，靶点作用于多条信号转导通路，如TNF信号通路、HIF-1信号通路、PI3K-Akt信号通路、FOXO信号通路、VEGF信号通路、T细胞受体信号通路、Toll样受体信号通路等。体外细胞研究显示，知母-黄柏30%醇洗脱部位能明显降低炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6及降低NO分泌，并降低iNOS和COX-2蛋白及基因表达，抑制NF-κB信号通路[9]。通过网络药理学发现，知母-黄柏药对可以调控NF-κB信号通路，影响PTGS2(即COX-2)表达，影响NO合成，以及TNF分泌，文献报道的实验结果与预测相吻合。在KEGG通路及生物过程分析时发现，知母-黄柏药对能影响胰岛素抵抗，因此其对糖尿病可能具有潜在的作用。已有的实验研究也证实知母-黄柏药对对糖尿病动物模型有明显的改善作用，能减轻对胰岛素的抵抗[2-3]，与预测相吻合。

炎症在肿瘤发生过程中具有重要作用，对炎症的调控成为肿瘤研究的热点。KEGG通路及生物过程分析发现，知母-黄柏药对对多种肿瘤具有潜在作用。研究显示，知母药材不同药用部位对人胃癌HGC-27细胞、人肝Hepg-2细胞和人结肠癌Caco-2细胞体外增值具抑制作用，并能抑制LPS诱导RAW264.7细胞释放NO[19]；黄柏的成分黄柏苷可以通过阻滞细胞周期，上调Bax因子的表达，同时下调Bcl-2因子的表达，并且激活caspase 3进而诱导A549细胞凋亡[20]。因此，基于已有的实验证据，知母-黄柏药对可以用于肿瘤治疗，临床肿瘤的中医治疗往往在中药复方基础上配伍知母-黄柏，其抗肿瘤作用可能与炎症密切相关。

总之，本研究运用网络药理学方法揭示了知母-黄柏药对的抗炎作用机制。知母-黄柏药对通过多种成分、多靶点共同调控炎症信号通路及炎症疾病通路，影响炎症生物学过程，发挥抗炎作用，从而治疗疾病。本研究为知母-黄柏药对“相须”配伍提供了分子依据，基于网络药理学研究深入挖掘知母-黄柏药对的分子机制将有利于其在临床上的精准使用。