绵羊MyoG基因多态性与胴体体尺性状的相关性分析

任思睿，胡慧宇，任亭亭，刘明军，李文蓉，张 宁，张雪梅，刘晨曦，贺三刚*

(1.新疆农业大学动物科学学院，乌鲁木齐830052；2.新疆畜牧科学院生物技术研究所，乌鲁木齐830011)

特克塞尔羊原产自于荷兰特克塞尔岛，为我国引进的肉用羊品种。自1995年以来，我国的一些省、市、地区先后引入该品种，如陕西、宁夏、北京、甘肃和辽宁等地区，对当地品种进行杂交改良，效果显著[1]。哈萨克羊，产地为新疆维吾尔自治区天山北麓与阿尔泰山南麓地区，是一种肉、脂兼用的粗毛羊。因其常年在季节性草场转场放牧，所以放牧性能良好，对环境适应能力强，善于爬山游走，耐寒抗病，耐粗饲，曾作为母系品种参与了新疆细毛羊的繁育[2]。因其产肉能力不足，与特克塞尔羊进行杂交改良可以提高其产肉性能，获得更大的经济效益。

生肌调节因子(MRFs)基因家族编码4种不同的肌肉特异性的转录因子，分别为生肌决定因子(myogenic determining factor，MyoD)、肌细胞生成素(myogenin，MyoG)、生肌调节因子5(Myf5)和生肌调节因子6(Myf6)[3]。在绵羊中，MyoG基因位于第12号染色体，含有2个内含子和3个外显子[4]。肌细胞生成素(Myogenin，MyoG)是MRFs基因家族在所有骨骼肌细胞系中唯一一个可表达的基因[5]。MyoG基因可以激活肌肉的基因转录，提高肌细胞分化增值，调控肌纤维的融合，在肌纤维的形成过程中，前体肌细胞的增殖以及定型，到个体出生之后的骨骼肌功能的完善以及成熟等过程起到中心调控的作用[6-9]。且MyoG基因可调节Myf6基因的表达，调节肌肉的特异基因，如肌肉肌酸激酶、肌钙蛋白、肌球蛋白轻链基因的表达[10]。现在关于MyoG基因多态性的研究一般以猪和牛的研究居多，主要涉及基因多态性与肉质品质和胴体生长性状的关联研究[11]。研究表明，MyoG基因是控制肌肉生长发育的关键基因，且与出生时的肌纤维数目密切相关，当其撤回或降低时，成肌细胞的分裂与分化就会立即停止[12]。所以可以通过调节和改变MyoG基因相关位点的选育增强上述指标表现，提高产肉能力和肉品品质，从而满足人们对高品质和高产肉性状的需要[13]。

本试验对特克塞尔×哈萨克羊横交F2代434只个体的MyoG基因SNP位点与胴体体尺性状进行关联分析。筛选出对绵羊胴体体尺性状有重要作用的SNP位点，来提高绵羊瘦肉率和产肉率，对新疆地区绵羊品种的遗传特性和优良性状进行深入系统的发掘与利用，有利于绵羊肉用生产性能的改良和选育。

1 材料与方法

1.1 试验动物及DNA样品采集

试验动物均来自新疆畜牧科学院生物技术研究中心所属的绵羊繁育试验基地，为2014-2019年屠宰的特克塞尔×哈萨克横交F2代绵羊(即特克塞尔公羊与哈萨克母羊杂交获得F1代羊，F1代公羊和F1代母羊交配获得横交F2代羊)，共434只。该群体均为饲养管理统一、年龄相同、体型相近、生长状况良好的绵羊。采集434份绵羊耳组织样品，记录样品耳标号和芯片号，分装于2 mL冻存管中(内盛有75%的乙醇)，于-20℃冷冻保存。

1.2 试验方法

1.2.1 胴体体尺相关性状的测定

测定屠宰后绵羊的胴体重、胴体长、胸宽、肩宽、胸深、臀宽和踝骨宽胴体体尺性状体尺数据。测定方法如下：

①胴体重(Carcass weight,CW)：将试验动物屠宰彻底放血，并去掉动物的皮毛、内脏、头和蹄剩余的重量，重量单位为公斤(kg)，小数点后保留两位；

②胴体长(Back length,BL)：用皮(软)尺量取由肩端前缘至同侧尾根的直线距离。②～⑦表型性状的长度测量单位均为厘米(cm)，小数点后保留两位；

③踝骨宽(Bone thickness at malleolus,BM)：用皮(软)尺量踝骨宽；

④臀宽(Back dorsal width at pelvis,BP)：骨盆处的背部宽度，用测仗测量；

⑤胸宽(Back dorsal width at thorax,BT)：测定沿肩胛骨后方，从鬐甲到胸骨的垂直距离，用测仗测量；

⑥肩宽(Back dorsal width at shoulder,BS)：肩部处的背部宽度，用测仗测量；

⑦胸深(Dorsoventral height at thorax,TH)：胸腔的高度，用测仗测量。

1.2.2 DNA提取及质量检测

依照血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(目录号：DP304)说明书提取434只绵羊耳组织的DNA。使用1.0%的琼脂糖的凝胶电泳检测样本DNA的完整性，使用Nanodrop One超微量分光光度计检测样本DNA的纯度和浓度，确保OD260/OD280值为1.8～2.0。

1.2.3 PCR引物设计与合成

根据GenBank Oar_v4.0(NC_019469.2)提供的绵羊MyoG基因序列，将序列分成三段进行PCR扩增，扩增长度约为3 100 bp。采用软件Primer 5.0和National Center for Biotechnology Information在线相结合的方式设计3对引物(见表1)。引物由上海生工生物股份有限公司进行合成。

表1 MyoG基因引物序列

1.2.4 PCR扩增及产物检测

PCR反应体系为50 μL：2×Taq Master Mix 25 μL，上下游引物(补充浓度)各1 μL，模板DNA(补充浓度)2 μL，ddH2O 21 μL。PCR反应程序：95℃预变性5 min，35个循环(95℃变性30 s、最佳退火温度30 s、72℃延伸45 s)，72℃终延伸10 min，产物4℃保存。用1.5%的琼脂糖凝胶电泳进行PCR产物检测(见图1)。

图1 MyoG基因PCR产物琼脂糖检测

1.2.5 DNA双向测序

从434只特克塞尔×哈萨克横交F2代绵羊中随机挑选50只个体进行MyoG基因组序列扩增，将3段序列进行DNA双向测序，筛选SNP位点。由上海生工生物股份有限公司进行DNA测序。

1.2.6 Sequenom MassARRAY○RSNP检测分型

用Sequenom MassARRAY○RSNP检测384只绵羊的MyoG基因SNP位点基因型，由新疆康普森生物技术有限公司完成。

1.3 统计方法

利用Microsoft Excel 2016计算基因频率、基因型频率、期望杂合度、观测杂合度、多态信息含量、有效等位基因数和Hardy-Weinberg平衡，并利用SPSS 23.0软件中的一般线性模型进行最小二乘方差对基因中的不同基因型与胴体体尺性状进行相关性分析，一般线性模型为：

式中：Yijk为个体表型值，μ为群体平均值，Gi为个体基因型效应，Sj为个体性别效应，Mk为个体屠宰年份，Eijk为随机残差效应。结果用“均值±标准误”来表示。

2 结果与分析

2.1 SNP位点的检测结果

将MyoG基因的测序结果与GenBank公布的序列进行比对(登录号:NC_019469.2)，共发现6个SNP位点，分别为rs600781279、rs407552631、rs410212255、rs419534498、rs400160301和rs405981477(rs号来源于参考文献[16])，均位于内含子上。其中，rs600781279和rs407552631位于内含子Ⅰ上，rs410212255、rs419534498、rs400160301和rs405981477位于内含子Ⅱ上，6个SNP多态性位点的信息见表2。

表2 MyoG基因中的SNP位点

2.2 Sequenom MassARRAY○RSNP分型结果

检测6个SNP位点在剩余384只绵羊的基因型，分型结果如下(见图2)，至此共得到434只绵羊的SNP位点信息数据。

图2 MyoG基因飞行时间质谱分型结果

2.3 MyoG基因多态性分析

2.3.1MyoG基因变异频率分析和Hard-Weinberg平衡检验

对哈代-温伯格平衡检验定律来说，当P＞0.05时，说明群体中基因出处于遗传平衡状态。由表3可知，MyoG基因的6个SNP位点在特克塞尔×哈萨克横交F2代绵羊群体中都处于平衡状态。就基因频率和基因型频率而言，rs600781279、rs410212255和rs419534498 3个SNPs的G等位基因、rs407552631的T等位基因、rs400160301的A和rs405981477的C为优势等位基因。并且rs600781279的优势等位基因型为GG，rs410212255的优势等位基因型为GG，rs419534498的优势等位基因型为GG，rs407552631的优势等位基因型为TT，rs400160301的优势等位基因型为GA，rs405981477的优势等位基因型为CC。

表3 MyoG基因变异频率及Hardy-Weinberg平衡检验

续表

2.3.2MyoG基因多态性分析

表4 列出了MyoG基因SNP各个位点的多态性，分析可知rs407552631、rs400160301和rs405981477属于中度多态(0.25＜PIC＜0.5)，rs600781279、rs410212255和rs419534498属于低度多态(PIC＜0.25)。

表4 MyoG基因多态性分析

2.3.3MyoG基因与胴体体尺性状的关联分析

由表5可知，在特克塞尔×哈萨克横交F2代群体发现的6个SNP位点中，有4个位点与胴体体尺性状显著相关，它们分别为rs600781279、rs407552631、rs410212255和rs400160301。MyoG基因对胴体重和胴体胸宽的影响不显著(P＞0.05)。在rs600781279的基因型效应中，GG基因型个体鉴定时的踝骨宽极差异显著高于AG基因型个体(P＜0.01)。在rs407552631的基因型效应中，GT基因型个体鉴定时的胴体长、臀宽和踝骨宽差异显著高于TT基因型个体(P＜0.05)，GT基因型个体鉴定时的肩宽差异极显著高于TT基因型个体(P＜0.01)。在rs410212255的基因型效应中，GA基因型个体的胸深显著高于GG基因型个体(P＜0.05)。在rs400160301的基因型效应中，GA基因型个体鉴定时的胴体长差异显著高于AA基因型个体(P＜0.05)，GG基因型个体鉴定时的肩宽和胸深差异显著高于AA基因型个体(P＜0.05)，GG基因型个体鉴定时的臀宽差异极显著高于AA基因型个体(P＜0.01)，GA基因型个体鉴定时的臀宽差异极显著高于AA基因型个体(P＜0.01)，GA基因型个体鉴定时的踝骨宽差异极显著高于AA基因型个体(P＜0.01)。

表5 MyoG基因与胴体体尺性状的关联分析

注：同列数据不同大写字母表示差异极显著（P＜0.01）、不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）、相同字母表示差异不显著（P＞0.05）。

3 讨 论

根据研究发现，脊椎动物肌肉组织中的肌纤维在胚胎时期就已经形成，且动物出生以后肌纤维数目不改，肌肉的生长发育主要依靠肌细胞分化增殖从而促使肌纤维的长度增加和直径增大，而不是依靠肌肉细胞的增殖，因此动物的肌纤维数目的多少决定了它产肉能力的大小[14]。MyoG基因是MRFs基因家族中唯一可在所有骨骼肌细胞中可表达的基因。MyoG基因可以调控肌细胞分化，促使单核成肌细胞融合为多核肌管，终止成肌细胞的增殖[15]。

本试验利用DNA双向测序技术和飞行时间质谱分型技术检测了434只特克塞尔×哈萨克横交F2代绵羊MyoG基因的多态性。结果发现了6个位于内含子上的SNP位点，均处于哈代-温伯格平衡状态。其中rs407552631、rs400160301和rs405981477属于中度多态，rs600781279、rs410212255和rs419534498属于低度多态。把突变位点与胴体体尺性状的相关性进行分析，共发现4个与胴体体尺性状相关的SNP位点，在rs600781279中存在AA、AG、GG三种基因型，其中GG基因型个体的踝骨宽差异极显著高于AG基因型个体(P＜0.01)。在rs407552631中存在GG、GT、TT三种基因型，其中GT基因型个体的胴体长、臀宽和踝骨宽差异显著高于TT基因型个体(P＜0.05)，TT基因型个体的肩宽极显著低于GT基因型个体(P＜0.01)。在rs410212255中存在GA、GG两种基因型，其中GA基因型个体的胸深差异显著高于GG基因型个体(P＜0.05)。在rs400160301中存在GG、GA、AA三种基因型，其中GA基因型个体的胴体长差异显著高于AA基因型个体(P＜0.05)，GA基因型个体的臀宽差异极显著高于AA基因型个体(P＜0.01)，GG基因型个体的臀宽差异极显著高于AA基因型个体(P＜0.01)，GG基因型个体的肩宽和胸深差异显著高于AA基因型个体(P＜0.05)，GA基因型个体的踝骨宽极差异显著高于AA基因型个体(P＜0.01)。

韩银仓等[14]运用PCR-SSCP和DNA测序的方法对3个群体632只藏羊的MyoG基因第一外显子进行检测，结果发现第一外显子的109 bp处存在单碱基突变，该SNP变异导致MyoG基因第一外显子37号位的编码的氨基酸发生突变，由谷氨酸(GAG)突变为丙氨酸(GCG)。其与藏羊生长性状关联分析表明，在贵南县藏羊群体中AA基因型CA和基因型个体鉴定时的体长差异显著大于CC基因型个体(P＜0.05)，在河南欧拉羊群体中AA基因型个体鉴定时的体高、体重和体长均差异显著小于CC基因型个体(P＜0.05)，在祁连县高原藏羊群体中AA基因型个体鉴定时的体重差异显著小于CC基因型个体(P＜0.05)。Junior等[16]通过测序技术研究发现在圣伊内斯羊(Santa Inês sheep)MyoG基因中有17个SNP位点，但并没有分析这17个SNPs与胴体体尺性状的相关性。然而，其中6个SNP位点与本文报道的6个SNP位点相同。目前对绵羊MyoG基因的研究较少，本次研究新发现4个与绵羊胴体体尺性状相关的SNP位点，为与绵羊胴体体尺性状相关的分子标记的筛选提供了参考和理论基础。因此，后续试验可以增加不同品种绵羊的群体数量，深入探讨MyoG基因与绵羊胴体体尺性状相关性。

4 结 论

本试验检测特克塞尔×哈萨克横交F2代绵羊群体中MyoG基因的SNP位点，并分析了这些SNP位点对胴体体尺性状的相关性。MyoG基因rs600781279、rs407552631、rs410212255和rs400160301与绵羊胴体长、肩宽、胸深、臀宽和踝骨宽显著相关。其中，rs600781279与踝骨宽显著相关，rs407552631与胴体长、肩宽、臀宽和踝骨宽显著相关，rs410212255与胸深显著相关，rs400160301与肩宽、胸深、臀宽和踝骨宽显著相关。研究为MyoG基因作为绵羊胴体体尺性状的候选基因应用于绵羊遗传育种提供了参考。