小儿七星茶颗粒中甘草酸含量测定的不确定度研究

骆海春,陆雪芳,朱飞如,冯俊富（.北海市食品药品检验所,广西 北海 536007;.广西医科大学第一附属医院,广西 南宁 5300）

小儿七星茶颗粒的主要成分为薏苡仁、稻芽、山楂、淡竹叶、钩藤、蝉蜕、甘草。七药合用，主治小儿开胃消滞，清热定惊。用于小儿积滞化热，消化不良，不思饮食，烦躁易惊，夜寐不安，大便不畅，小便短赤[1]。其中甘草的活性成分为甘草酸，具有显著改善患儿免疫功能的效果。甘草酸含量测定中受测定工具的影响较大，常规测定方法无法收到满意的效果，而UPLCMS/MS法的实施，配合不确定度影响，也更能提升药物的含量[2]。本研究为分析小儿七星茶颗粒中甘草酸含量测定的不确定度，特就小儿七星茶颗粒进行受试分析，相关实验报告如下。

1 一般材料与方法

1.1 一般研究材料 采用医学研究验证法，选择化学室接受小儿七星茶颗粒中甘草酸含量测定的40例样本进行研究，按照UPLCMS/MS法应用与否，就受试样本的不确定度进行分析。

1.2 方法 对照组为常规检测组，研究组为UPLC-MS/MS法测定组，临床观察二者含量检测不确定度符合情况并建立不确定度计算方法。

对照组：应用甘草浸膏粉—甘草酸的测定—毛细管区带电泳法对受试样本进行测定，甘草酸与甘草酸转化器和甘草酸酶混合物反应形成中间体，中间体与高度特异的探针反应产生颜色，在OD=450nm时可被检测到。

该产品可以检测到低于20μm的甘草酸。

甘草酸测定方案概述：①在井中添加样品和标准品；②加入甘草酸转换器，孵育1小时；③加入反应混合物，孵育1小时；④分析与孔板。

研究组：使用KromasiL-C18（4.6mm×200mm，5μm）柱，甘草苷采用乙腈-0.5%醋酸（20∶80）为流动相，检测波长276nm，柱温为室温；甘草酸流动相为甲醇-0.2mol·L-1乙酸铵溶液-冰乙酸（67∶32∶1），检测波长252nm，柱温为室温。二者流速均为1.0ml·min-1，采用外标法定量测定；采用UPLCMS/MS法测定薯蓣皂苷元和齐墩果酸在不同浓度(0，0.01，0.02，0.05，0.1，0.2，0.5，1mmol/L)甘草酸水溶液中的溶解度，并绘制溶解度曲线；在甘草酸浓度为0-1mmol/L范围内，薯蓣皂苷元和齐墩果酸的溶解度均随甘草酸浓度的增加呈上升趋势。当甘草酸溶液的浓度达到1mmol/L时，薯蓣皂苷元的溶解度增加约60倍(6.15→360.59ng/mL)；齐墩果酸的溶解度增加约60倍(20.09→1155.36ng/mL)。

对同一量，进行多次计量，然后算出平均值。对于偏离平均值的正负差值，就是其不确定度。其差值越大，则计量的不确定度就越大。

在数理统计学上，一般用方差（S）来表示：S2＝｛(x1－X)2+(x2-X)2+(x3-X)2……＋(xn-X)2｝/(n-1)。注：X为平均值，n为测量的次数。

方差越大，其不确定度则越大；方差越小，其不确定度就越小。

1.3 统计学方法 应用DAS 2.0.1版对所有数据进行统计分析，计数资料和计量资料分别用（%）、（±s）表示，用χ2、t检验，以P＜0.05有统计学意义。

2 结果

2.1 两组检测不确定度符合率情况 研究组检测不确定度符合率为95.00%（19/20），对照组检测不确定度符合率情况为80.00%（16/20），统计学意义特征对比明显（P＜0.05）。见表1。

表1 两组检测不确定度符合率情况比较（n/%）

2.2 UPLC-MS/MS法测定甘草酸含量不确定度分析 根色谱柱为Eurospher 100-5 C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；柱温：室温；流动相为乙腈∶0.05mol·L-1磷酸(二乙胺调pH=5)=70∶30；流速为1.0ml·min-1；紫外检测波长：264nm。结果：在该条件下，甘草酸主峰和杂质得到很好的分离，甘草酸浓度在10-200μg·ml-1范围内呈良好的线性，r=0.9999；平均回收率为98.1%，RSD=0.73%；甘草酸溶液在室温避光条件下放置5h内保持稳定。

3 讨论

小儿七星茶颗粒中甘草酸含量测定中，通过建立UPLC-MS/MS法甘草酸模型，分析影响含量不确定度的因素，更能提升标准曲线不确定度[3-4]。

王彦帅[5]等人的研究成果进一步表明，建立经典名方物质基准HPLC指纹图谱及多指标成分含量测定的方法，为物质基准质量标准研究提供依据；采用ACQUITY UPLC HSS T3(100mm×2.1mm，1.8μm)色谱柱，乙腈-0.2%磷酸水溶液梯度洗脱，流速为0.2ml·min-1，检测波长210nm，柱温为30℃；甘草酸3.51-35.10μg·ml-1(r=0.9998)，平均回收率为94.78%(RSD=1.72%)、96.84%(RSD=1.85%)(n=6)；桑皮苷对照组、甘草苷、甘草酸铵含量测定方法的平均加样回收率分别为97.82%、97.40%、105.81%，RSD分别为4.41%、2.51%、1.19%，均满足《中国药典》2015年版要求，3种成分分别在25.25-2525、25-2500、8.5-850ng线性关系良好，精密度、稳定性、重复性良好。对10批次泻白散物质基准进行含量测定，其中甘草苷质量分数、甘草酸质量分数结果分别为0.1-1.6mg/g。高效液相色谱法测定小儿七星茶颗粒中甘草酸含量的不确定度；以Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（1.7μm，2.1mm×50mm）分离，乙腈和水为流动相梯度洗脱，流速0.5mL·min-1[6]。用液相色谱法测定，生药分析方法：将甘草制成粉末，取该粉末约0.5g，精密称定，置入容量为50ml的离心管内，加流动相25ml，装上流冷凝管后，在85℃的水浴上加热15分钟，冷却后进行离心分离，将上清液移置50ml的容量瓶中。残渣再加流动相提取两次，每次加10ml振摇5分钟，离心分离，将其上清液并入上述容量瓶中，最后加流动相至刻度，作为样品溶液。此外，取甘草酸单铵盐对照品约0.06克，精密称定，置入50ml的容量瓶中，加流动相溶解后调至刻度。准确量取该液25ml置入50ml容量瓶中，加流动相调至刻度，作为对照品溶液。准确取样品溶液和对照品溶液各10ml注入高效液相色谱仪中，按上述色谱条件进行分析，测定各溶液中甘草酸的峰面积，并由此计算样品中甘草酸含量，甘草酸单铵盐换算成甘草酸的换算系数为0.9797。对三个不同产地的甘草样品进行分析，测得甘草酸的含量[7]。建立不确定度计算方法，在HPLC法测定该药物中芍药苷和甘草酸的合成不确定度、扩展不确定度。芍药苷和甘草酸含量测定结果对比分别为0.032mg·g-1VS 0.030mg·g-1、0.064mg·g-1VS 0.060mg·g-1、(3.514±0.064)mg·g-1VS (2.987±0.060)mg·g-1[8]。成功建立炙甘草UPLCMS/MS指纹图谱分析方法，采用超高效液相色谱-质谱联用技术(UPLC-MS/MS)，选择对照组CQUITY UPLC 研究组EH C18色谱柱(1.7μm，100mm×2.1mm)，以乙腈-0.2%甲酸水作为流动相，梯度洗脱80min，分别获得不同批次炙甘草及葛根芩连汤不同配伍组的色谱图；建立了炙甘草UPLC-MS/MS指纹图谱，确定了12个共有峰，指认12号峰为甘草酸铵[9]。

综上所述，UPLC-MS/MS法的实施，对提升小儿七星茶颗粒中甘草酸含量测定确定度具有显著的效果，值得在化学室的研究中加以推广实施。