LC-MS/MS法测定替格瑞洛原料药中的N，N-二乙基苯胺

王庆鹏 陈晓英 骆献丽 李 原 刘山崎 张明辉

乐普药业股份有限公司，河南郑州 450000

替格瑞洛主要用于急性冠状动脉综合征（包括不稳定性心绞痛、非ST段抬高心肌梗死或ST段抬高心肌梗死）患者，包括接收药物治疗和经皮冠状动脉介入（PCI）治疗的患者，降低血栓性心血管事件的发生率[1]。替格瑞洛的工艺杂质N，N-二乙基苯胺，被视为遗传毒性杂质[2-3]。遗传毒性杂质是指能引起DNA损伤，导致DNA突变的杂质，严重威胁人类健康，已被广泛关注及严控。主要来源于原料药或制剂的生产过程，如起始原料、反应物、催化剂、试剂、溶剂、中间体、副产物、降解产物等。根据欧洲EMEA、美国FDA和国际药品注册协调会议（ICH）及中华人民共和国药典（四部）关于基因毒性杂质的指导原则等要求[4-5]，液相色谱-质谱联用技术[6-15]具有灵敏度高、分析速度快、结果准确可靠的特点，可以满足痕量毒性杂质检测的要求。本研究建立了LC-MS/MS法，可准确、灵敏地测定替格瑞洛原料药中基因毒性杂质N，N-二乙基苯胺的含量。

1 仪器与试剂

AB SCIEX ExionLC-QTRAP5500高效液相色谱仪-三重四级杆线性离子阱质谱仪（美国AB SCIEX公司）；色谱柱为苯基柱（Ultimate®UHPLC XB-Phenyl，2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；MS205DU型电子分析天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）。

甲 醇（LC/MS级 别，Fisher），乙 腈（LC/MS级别，Fisher），甲酸（HPLC级别，Dikmapure），水（蒸馏水，屈臣氏）；对照品：N，N-二乙基苯胺（批号：20170426，纯度：99.5%，国药集团化学试剂有限公司）；替格瑞洛原料药（批号：Q19010701G、Q19010702G、Q19010703G，浙江乐普药业股份有限公司）。

2 方法与结果

2.1 方法条件

2.1.1 色谱条件 液相色谱柱：Ultimate®UHPLC XB-Phenyl（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流 速0.3 ml/min；以0.1% 甲酸水溶液为流动相A，以0.1% 甲酸甲醇溶液为流动相B，梯度洗脱（0～1.5 min，5% B→ 70% B；1.5～10.0 min，70% B；10.0～10.5 min，70%B→95%B；10.5～18.0 min，95%B；18.01～22.0 min，5% B）；柱温：40℃；进样体积：5 μl；供试品测定，于0.5 min时通过阀切换将流路切入质谱仪进行检测，于6.5 min时将流路切至废液，避免高浓度替格瑞洛进入质谱仪而污染仪器。

2.1.2 质谱条件 电喷雾离子源（electron sprayionization，ESI），正离子模式采集；多反应离子监测模式（multiple reaction montoring，MRM），定 量 离 子 对150.2/106.0；电喷雾电压（IS）：5500 V；涡旋离子喷雾温度：550℃；气帘气（CUR）：40；碰撞池气体：Medium；雾化气（Gas1）：55；辅助气（Gas2）：60；入 口 电 压（EP）：10 V；碰 撞 室 出 口 电 压（CXP）：13 V；碰撞能（CE）：34；去簇电压（DP）：90 V；驻留时间：100 ms。

2.2 溶液配制

2.2.1 对照品贮备溶液 对照品贮备溶液Ⅰ：称取N，N-二乙基苯胺对照品适量，精密称定，加入甲醇适量，使溶解，并用稀释剂[甲醇-乙腈-水（1∶1∶2）]定量稀释制成每1 ml中约含160 ng的溶液。对照品贮备溶液Ⅱ：精密量取对照品贮备溶液Ⅰ适量，用稀释剂[甲醇-乙腈-水（1∶1∶2）]定量稀释制成每1 ml中约含8 ng的溶液。

2.2.2 对照品溶液 精密量取对照品贮备溶液Ⅰ适量，用稀释剂[甲醇-乙腈-水（1∶1∶2）]定量稀释制成每1 ml中约含8 ng的溶液。

2.2.3 供试品溶液 取替格瑞洛约20 mg，精密称定，置20 ml量瓶中，加入稀释剂[甲醇-乙腈-水（1∶1∶2）]适量，振摇使溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性试验 取稀释剂、对照品溶液和供试品溶液照上述条件进行试验，记录色谱图，结果见图1。稀释剂（空白溶剂）和供试品溶液不干扰N，N-二乙基苯胺的测定。

图1 典型色谱图

2.3.2 线性关系、检测限和定量限实验 精密量取“2.2.1”项对照品贮备溶液Ⅰ适量，分别用稀释剂[甲醇-乙腈-水（1∶1∶2）]定量稀释制成每1 ml中 约 含0.2、0.4、1.2、4、8、12、16 ng（2.5%～200%限度浓度）的系列浓度的线性溶液。依法测定，结果以浓度为横坐标、峰面积为纵坐标进行线性回归，其线性方程：y=1360 211.0060x+ 62 126.0011，相关系数r=0.9999。表明N，N-二乙基苯胺在0.20～15.80 ng/ml的浓度范围内，线性关系良好。

精密量取“2.2.1”项对照品贮备溶液Ⅱ适量，用稀释剂[甲醇-乙腈-水（1∶1∶2）]进行逐级定量稀释。当峰高与噪音的信噪比（S/N）大于10∶1时，即定量限溶液；当峰高与噪音的信噪比（S/N）大于3∶1时，即检测限溶液。依法测定，结果N，N-二乙基苯胺的定量限（LOQ）为0.2 ng/ml（S/N=15.1）；检测限（LOD）为0.06 ng/ml（S/N=4.1）。

称取替格瑞洛样品约20 mg，精密称定，置20 ml量瓶中，精密加入“2.2.1”项对照品贮备溶液Ⅱ 0.5 ml，加入稀释剂[甲醇-乙腈-水（1∶1∶2）]适量，振摇使溶解，并用稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为定量限浓度加标供试品溶液。平行配制6份。依法测定，结果N，N-二乙基苯胺平均加样回收率为107.5%，RSD为1.7%（n=6）。

2.3.3 回收率和精密度实验 称取替格瑞洛样品约20 mg，精密称定，平行9份，分别置20 ml量瓶中，精密加入“2.2.1”项对照品贮备溶液Ⅰ各0.5、1.0、1.5 ml，每个浓度水平平行3份，加入稀释剂[甲醇-乙腈-水（1∶1∶2）]适量，振摇使溶解，并稀释至刻度，摇匀，作为50%、100%和150%限度浓度加标供试品溶液。依法测定，结果见表1。平均加样回收率为95.3%，RSD为0.84%（n=9）。

表1 加样回收率实验结果

2.3.4 仪器精密度、重复性、稳定性实验 取“2.2.2”项下的对照品溶液，依法测定，连续进样6次，结果N，N-二乙基苯胺峰面积的RSD为1.9%、保留时间的RSD为0.2%。

称取替格瑞洛样品约20 mg，精密称定，置20 ml量瓶中，精密加入“2.2.1”项下的对照品储备溶液Ⅰ 1.0 ml，加入稀释剂[甲醇-乙腈-水（1∶1∶2）]适量，振摇使溶解，并稀释至刻度，摇匀，作为100%限度浓度加标供试品溶液。平行配制6份。依法测定，结果N，N-二乙基苯胺含量的RSD为0.56%。

按照“2.2.2”和“2.3.3”项下溶液配制方法，分别新鲜配制对照品溶液和100%限度浓度加标供试品溶液，在室温条件放置，于0、2、4、6、8、10、12、24 h时，依法测定，结果对照品溶液和100%限度浓度加标供试品溶液室温放置24 h内稳定（峰面积RSD＜3.0%）

2.4 样品测定

称取替格瑞洛（批号：Q19010701G、Q19010702G、Q19010703G）样品各约20 mg，精密称定，分别置20 ml量瓶中，加入稀释剂[甲醇-乙腈-水（1∶1∶2）]适量，振摇使溶解，并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。依法测定，结果3批替格瑞洛中均未检测出N，N-二乙基苯胺。

3 讨论

3.1 溶剂选择

根据替格瑞洛的溶解性和色谱条件梯度流动相初始比例，进行溶剂筛选。在稀释剂筛选过程中，替格瑞洛在甲醇-水（4∶6）中未溶解；在甲醇-水（1∶1）和乙腈-水（35∶75）中均溶解，但N，N-二乙基苯胺峰分叉，经分析存在溶剂效应。N，N-二乙基苯胺极性强，易溶于水。结合色谱条件，色谱条件梯度初始比例甲醇-水（5∶95），当溶剂中甲醇比例高时，存在溶剂效应，故须降低溶剂中甲醇比例。N，N-二乙基苯胺峰处流动相有机相甲醇比例约占70%和替格瑞洛在低比例乙腈溶剂中易溶的特性，优先采用甲醇-乙腈-水的混合溶剂[甲醇-乙腈-水（1∶1∶2）]，结果N，N-二乙基苯胺峰型良好，无溶剂效应。

3.2 色谱条件选择

根据N，N-二乙基苯胺的一级质谱扫描所得母离子（Q1）峰归属均为[M+H]+，要求流动相可以提供+H的离子化环境，优先考虑挥发性酸和甲醇，结果以0.1%的甲酸水溶液和0.1%甲酸的甲醇溶液为流动相，为其提供稳定离子化环境。由于N，N-二乙基苯胺具有易随水蒸气挥发的特性，在溶剂[甲醇-乙腈-水（1∶1∶2）]中易挥发。溶液制备和进样过程中，避免因挥发导致交叉污染。自动进样器控温4℃和样品进样前保持密封，可有效降低交叉污染。

3.3 质谱条件选择

在本方法条件下，替格瑞洛出峰位置在6.8 min处，由于其样品浓度较高，于0.5 min时通过阀切换将流路切入质谱仪进行检测，于6.5 min时将流路切至废液，避免高浓度替格瑞洛进入质谱仪污染仪器。通过一级和二级质谱扫描确定了定量离子对（Q1/Q3）150.2/106.0。在MRM模式下，优化得到碰撞能为34和去簇电压为90 V。改善雾化效果，提高气帘气为40、雾化气为55和辅助气60，其它质谱参数均采用仪器推荐值。N，N－二乙基芳香胺类化合物中的氮原子含有孤对电子，容易缔合质子，形成稳定的质子化离子[M+H]+，在一级质谱图中可检测到基峰N，N-二乙基苯胺质子化分子离子m/z 150.2，见图2。在二级质谱图中可检测到子离子m/z 106.0，见图3。推断碎裂过程：母离子m/z 150.2发生裂解形成离子中性复合物后，继续发生氢迁移和单电子转移，形成离子m/z 121.1，并在自由基驱动下发生α断裂丢失甲基自由基产生子离子m/z 106.0，见图4[16]。

图2 N，N-二乙基苯胺的一级质谱图

图3 N，N-二乙基苯胺的二级质谱图

图4 质子化N，N-二乙基苯胺的碎裂过程

本研究建立了采用超高效液相色谱-质谱联用技术测定替格瑞洛原料药中N，N-二乙基苯胺含量的方法，并进行了方法学验证及样品检测，结果在3批样品中均未检出N，N-二乙基苯胺。根据人用药品注册技术要求国际协调会（ICH）发布基因毒性杂质的最大摄取量为1.5 μg/d[4]。结合替格瑞洛片说明书[1]最大日剂量180 mg，计算其限度为8.3 ppm，并按照限度为8 ppm进行控制。该方法专属性强，灵敏度高，满足基因毒性杂质测定要求，可准确地测定替格瑞洛原料药中N，N-二乙基苯胺，以有效控制原料药的质量。