强直性脊柱炎患者T、B及NK淋巴细胞亚群检测的临床价值

刘 倩，马 亮，岳德波，刘 辉，姜永玮，徐英春

（1.中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院 检验科，北京 100730；2.中日友好医院 检验科，北京 100029；3.中日友好医院 骨科，北京 100029）

强直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS）是一种慢性自身免疫性炎症疾病，以侵犯骶髂关节、脊柱中轴关节为主。随着疾病进展可发生脊柱畸形和关节强直，更甚者脊柱硬化无法弯曲而致残。中国汉族人群AS 患病率约为0.2%～0.3%，并且发病多集中于青壮年男性。AS 的发病机制较为复杂，尚未明确[1]，可能与遗传、免疫功能、感染及环境等因素相关。研究表明人类白细胞抗原B27（HLA-B27）[2]与AS 的发病密切相关；免疫性疾病常存在T、B、NK 淋巴细胞介导的细胞与体液免疫功能异常[3]，与疾病的发生发展及预后转归等密切相关，因此通过检测AS 患者HLA-B27 基因及分型，以及不同亚型间淋巴细胞亚群分布，在一定程度上可反映出机体细胞、体液等免疫水平。本研究通过分析AS 患者外周血淋巴细胞亚群与疾病之间的关系，初步探讨淋巴细胞亚群检测在AS中的临床应用价值。

1 对象与方法

1.1 研究对象

纳入2018年～2020年中日友好医院骨科、风湿免疫科等科室确诊的121 例AS 患者，及健康对照组120 例。AS 纳入标准：符合美国风湿病协会 （American Rheumatology Association，ARA）1984年修订的纽约标准[4]，临床资料完备。排除标准：有其他自身免疫性疾病；合并感染性疾病；合并恶性肿瘤等消耗性疾病； 孕期及哺乳期妇女。以上患者或其监护人均签署知情同意书。

1.2 采血及检测方法

121 例AS 患者及120 例健康对照人群，均在清晨空腹状态下采集静脉血2ml，乙二胺四乙酸二钾（EDTA-K2）抗凝，用于HLA-B27 基因分型及淋巴细胞亚群的检测。

核酸制备提取： 采用天隆科技公司Ex-DNA全血提取试剂盒按照说明书要求与步骤提取DNA，并且采用Nanodrop1000 微量分光光度计测定每份DNA 的浓度和纯度。

HLA-B27 基因分型检测：采用秀鹏生物技术开发有限公司HLA-B27 基因分型测定试剂盒对上述样本进行基因分型检测。PCR 循环参数：96℃2min；96℃20s，68℃1min，循环5 次；96℃20s，65℃50s，72℃45s，循 环10 次；96℃20s，62℃50s，72℃45s，循环15 次；72℃2min。ABI7500 荧光定量PCR 分析仪进行熔解曲线分析，得出HLA-B27 基因分型结果。

淋巴细胞亚群检测：取3 个样品测定管，每管中100μl 抗凝全血，加入50μl 荧光标记的单克隆抗体CD3-藻红蛋白-CY5 耦联物（CD3-PC5）/CD4-异硫氰酸荧光素（CD4-FITC）/CD8-藻红蛋白（CD8-PE）、CD5-异硫氰酸荧光素（CD5-FITC）/CD19-藻红蛋白（CD19-PE）、CD3-异硫氰酸荧光素 （CD3-FITC）/CD16、56-藻红蛋白（CD16，56-PE），混匀后在室温下避光孵育30min；加入500μl Optilyse C 全血溶解试剂震荡，室温静置15min；加入稀释液2.5ml 充分混匀后1500r/min 离心5min，弃上清后加入0.5ml 稀释液，轻轻混匀后及时进行流式细胞术检测；Beckman Coulter 流式细胞仪以淋巴细胞设门，检测荧光标记后的细胞，读取CD3+（T）%、CD3+CD4+（Th）%、CD3+CD8+（Ts）%、CD19+CD5+（B1）%、CD19+CD5-（B2）%、CD3-CD16+CD56+（NK）%，计算Th/Ts，记录实验数据。

1.3 统计学方法

应用SPSS 22.0 软件对数据进行统计分析。计量资料以x－±s 表示，采用成组设计t 检验；计数资料以率表示，组间比较采用卡方检验。

2 结果

2.1 临床特征

表1 示，121 例AS 患者，男女比3.2∶1；发病年龄（26.5±11.8）岁，病程（13.8±10.8）年；120 例健康对照人群，男女比3.1∶1。2 组间性别、年龄差异均无统计学意义（均P＞0.05）。详见表1。

2.2 HLA-B27 基因及分型检测

121 例AS 患者HLA-B27 基因 阳性101 例，阴性20 例；101 例HLA-B27 基因阳 性AS 患者中，HLA-B2704 型58 例（57.4%），HLA-B2705 型40 例（39.6%），HLA-B2702 型1 例（1.0%），HLAB2704*HLA-B2705 复合杂合子2 例（2.0%）。120例健康对照人群中HLA-B27 基因阳性3 例（2.5%），其中HLA-B2704 型1 例，HLA-B2705 型2 例；HLA-B27 基因阴性117 例（97.5%）。AS 组HLA-B27 基因阳性率 （83.5%） 显著高于对照组（2.5%），差异具有统计学意义（P＜0.01），见表1。

表1 AS 患者与健康对照人群临床特征及HLA-B27 基因阳性率比较

2.3 AS 患者与健康对照人群淋巴细胞亚群检测结果比较

表2 示，与健康对照人群相比，AS 患者CD3+CD8+（Ts）%、CD3-CD16+CD56+（NK）%显著降低，CD3+CD4+（Th）%、Th/Ts、CD19+CD5+（B1）%、CD19+CD5-（B2）% 显著升高，差异均具有统计学意义（P＜0.01）。CD3+（T）% 2 组间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

表2 AS 组患者与健康对照组淋巴细胞亚群结果比较（±s）

表2 AS 组患者与健康对照组淋巴细胞亚群结果比较（±s）

注：与健康对照组比较，**P＜0.01。

组别 n T% Th% Ts% Th/Ts B1% B2% NK%AS 组 121 74.2±7.8 44.7±8.2** 25.3±7.6** 2.0±0.8** 3.0±2.0** 11.3±5.9** 10.7±6.9**健康对照组 120 72.9±10.5 39.9±8.5 33.0±7.5 1.3±0.5 0.9±0.7 7.4±2.7 18.9±8.9

2.4 HLA-B2704、HLA-B2705 型之间AS 患者淋巴细胞亚群检测结果比较

与HLA-B2704 型AS 患者相比，HLA-B2705型AS 患者T%、Th%、Th/Ts 显著升高，B1%、NK%显著降低，差异有统计学意义 （P＜0.01）。2 组Ts%、B2%比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。详见表3。

表3 HLA-B2704、HLA-B2705 型之间AS 患者淋巴细胞亚群结果比较（±s）

表3 HLA-B2704、HLA-B2705 型之间AS 患者淋巴细胞亚群结果比较（±s）

注：与HLA-B2705 型AS 组比较，**P＜0.01。

组别 n T% Th% Ts% Th/Ts B1% B2% NK%HLA-B2704 58 71.3±6.6** 40.8±7.5** 26.0±7.0 1.7±0.7** 3.5±2.2** 11.3±7.4 13.7±8.0**HLA-B2705 40 78.2±7.2 49.6±5.4 25.0±9.6 2.3±0.9 2.4±2.0 10.7±3.9 6.9±4.6

2.5 HLA-B27 基因阳性与阴性AS 患者淋巴细胞亚群检测结果比较

HLA-B27 基因阳性与HLA-B27 基因阴性AS 患者T%、Th%、Ts%、Th/Ts、B1%、B2%、NK%差异无统计学意义（P＞0.05）。详见表4。

表4 HLA-B27 基因阳性与阴性AS 患者淋巴细胞亚群结果比较（±s）

表4 HLA-B27 基因阳性与阴性AS 患者淋巴细胞亚群结果比较（±s）

组别 n T% Th% Ts% Th/Ts B1% B2% NK%HLA-B27 基因阳性 101 74.6±7.6 45.0±7.9 25.6±7.9 2.0±0.8 3.0±2.1 11.1±5.9 10.5±7.3 HLA-B27 基因阴性 20 71.6±9.9 42.8±10.7 23.2±4.9 2.0±1.1 2.7±0.7 12.7±6.1 11.7±2.8

3 讨论

AS 患病早期特征较为隐匿，除侵犯中轴关节外，常累及到外周关节及眼部、肺部、心脏、消化系统等。目前AS 病因以及发病机制尚不明确，除了人类白细胞抗原B27（HLA-B27）遗传假说[2]以外，研究表明免疫功能紊乱[5]可能同样在AS 的发病机制中发挥重要作用。人体内正常免疫功能依赖于各种免疫细胞之间的协作与制约，淋巴细胞主要包括负责细胞免疫功能的T 细胞和体液免疫功能的B 细胞，以及非特异性免疫功能的NK 细胞。T（CD3+）细胞主要包括Th（CD3+CD4+，辅助性T 细胞）和Ts（CD3+CD8+，抑制性T 细胞），Th 和Ts 细胞相互协调与制约，对维持机体免疫功能稳定起着至关重要的作用；B（CD19+）细胞可分为B1（CD19+CD5+）和B2（CD19+CD5-），B1 细胞一般被归为固有免疫细胞，可产生多反应性自身抗体，某些致病性自身抗体可能会诱导自身免疫疾病发生，B2细胞可分泌抗体，诱导抗体亲和力成熟并分化为浆细胞产生高亲和力抗体，参与体液免疫应答；NK （CD3-CD16+CD56+） 细胞是固有免疫细胞，可直接作用于T、B 细胞和分泌细胞因子的方式调节免疫功能，抑制自身反应性B 细胞增殖与分化，发挥免疫监视和早期抗感染作用。因此淋巴细胞亚群[6]的测定有助于了解AS 患者机体免疫状态及对疾病的监测。

本研究中，AS 患者男女比例约为3.2∶1，发病年龄（26.5±11.8）岁，病程（13.8±10.8）年，与其他流行病学队列研究结果相符[7]；AS 患者HLA-B27基因阳性率83.5%，以HLA-B2704 型和HLAB2705 型为主，与国内外回顾性研究阳性率和分型结果相一致[8，9]，并且显著高于健康对照组，证实AS 的发生与HLA-B27 基因呈高度相关[10]。

本次研究中，AS 患者Th%、Th/Ts、B1%、B2%均显著高于健康人群，Ts%、NK%显著低于健康人群，T%差异无统计学意义，提示AS 患者免疫功能紊乱，表现为细胞免疫功能失衡，体液免疫功能亢进，并且NK 细胞免疫功能下降，抑制细胞及体液免疫的功能也下降，有可能产生多种自身抗体及细胞因子，进一步导致自身免疫疾病加重，与国内其他研究结果相一致[11～13]，因此T 淋巴细胞亚群的失衡、B 淋巴细胞功能亢进、NK 淋巴细胞免疫监视功能下降，均参与了AS 的发生与发展。

研究还发现，HLA-B2705 型AS 患者T%、Th%、Th/Ts 显著高于HLA-B2704 型AS 患者，B1%、NK%显著低于HLA-B2704 型AS 患者，Ts%、B2%差异无统计学意义。故提示我们HLAB2705 型AS 患者细胞免疫失衡程度、NK 细胞下降程度均大于HLA-B2704 型AS 患者；目前对于CD19+B 研究较多，B1 细胞研究相对较少，本研究首次观察到HLA-B2704 型AS 患者体内B1 细胞增多程度大于HLA-B2705 型AS 患者。

与此同时，我们观察到HLA-B27 基因阳性与HLA-B27 基因阴性AS 患者T%、Th%、Ts%、Th/Ts、B1%、B2%、NK%差异无统计学意义，可能淋巴细胞亚群分布异常仅与AS 有关，而与是否携带HLA-B27 基因无关。虽然目前研究较少，但有文献[14]报道携带HLA-B27 基因的个体有较强的提呈与自身抗原相似的病毒抗原能力，在病毒感染后更容易出现识别自身抗原的细胞毒性T淋巴细胞，造成脊柱细胞损伤，进而引发AS。因本次研究中HLA-B27 基因阴性AS 患者较少，仅有20 例，故待后续研究纳入更多病例，再做分析。

综上所述，AS 的发生与HLA-B27 基因呈高度相关，AS 患者外周血T、B 及NK 淋巴细胞分布异常，免疫功能紊乱，且HLA-B2705 型AS 患者T 及NK 淋巴细胞分布异常程度比HLA-B2704型AS 患者严重。因此，HLA-B27 基因分型及淋巴细胞亚群检测，可以为疾病的发病机制、诊断以及评估患者免疫状态提供临床价值。