樟叶越桔幼茎愈伤组织诱导和不定根的再生*

李 雪，李国泽，杨 玲，唐军荣，赵 平，丁 勇

(1.西南林业大学，云南省高校林木生物技术重点实验室，云南 昆明 650224；2.西南林业大学，西南地区林业生物质资源高效利用国家林业与草原局重点实验室，云南 昆明 650224)

樟叶越桔(Vaccinium dunalianumWight)为杜鹃花科(Ericaceae)越桔属(Vaccinium)多年生木本灌木或小乔木，在中国多分布于云南、四川和贵州等地[1]。全株药用，具有祛风除湿和舒筋活络的功效[2]；其幼嫩叶芽经民间加工处理后可作为“雀嘴茶”品尝，其制作工艺可追溯到明代[3]。樟叶越桔化学成分丰富[4]，尤其因富含熊果苷、绿原酸和6′-O-咖啡酰熊果苷等重要天然次生代谢产物而具有多种生理活性[5-7]，在高质量化妆品研发、食品与医药等方面具有重要的潜在研究价值。

樟叶越桔生长缓慢，目前仍处于野生或尚未开发状态，加上近年来人们对其关注度的日益提高，其野生生境遭到严重破坏且程度日趋加剧，给樟叶越桔重要次生代谢产物的生产和开发带来巨大困难，而愈伤组织诱导和不定根分化是实现其重要次生代谢化合物生产和相关研究的重要途径。愈伤组织自身分裂能力强、生长快、周期短，可用于细胞悬浮培养[8]并大量生产次生代谢物；此外，愈伤组织在原生质体分离[9]和遗传转化应用[10-12]等方面也具有重要作用。不定根广泛应用于植物生物反应器培养，在人参 (Panax ginseng)[13]、丹参 (Salvia miltiorrhizaBunge)[14]和何首乌 (PolygonummultiflorumThunb.)[15]等名贵中药材重要次生代谢产物的生产中取得理想结果，为在工业水平生产重要次生代谢产物提供了可行性。近年来，愈伤组织诱导不仅在枸杞 (Lycium barbarumL.)[16]、泡桐 (Paulownia)[17]和杜仲(EucommiaulmoidesOliv.)[18]等木本植物取得进展，也在矮丛蓝莓 (V.angustifolium)[19]、高丛蓝莓 (V.corymbosum)[20]和越桔 (V.myrtillus)[21]等越桔属植物中取得突破。樟叶越桔作为一个新型民族资源植物，虽然前期已经初步建立了其组培技术体系[3,22-23]，但还未建立其以茎段为外植体的愈伤组织诱导体系。茎段具有易培养、变异小、增殖快和成活率高等特点[24]，因此，本研究以樟叶越桔幼嫩茎段为外植体，探究其愈伤组织诱导和不定根再生的最佳激素组合，建立其愈伤组织诱导和不定根的再生体系，为樟叶越桔种质资源保护和以其愈伤组织和不定根为材料的研究与应用提供一定的参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试母本材料为樟叶越桔组培瓶苗，最初由西南林业大学樟叶越桔研究课题组于2013年5月繁育[3]，经多次继代培养，现培养于西南林业大学云南省高校林木生物技术重点实验室。

试验中越桔属植物组织培养常用的木本植物培养基(WPM) 干粉、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-dichlorophenoxyacetic acid,2,4-D)、噻苯隆(thidiazuron,TDZ)和玉米素 (zeatin，ZT) 均购自北京索莱宝科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 试验材料的增殖培养

取同一来源、同一批次的樟叶越桔组培瓶苗，切成带2个叶片的茎段，在无菌操作台(SWCJ-2F)上垂直接种于添加蔗糖30 g/L、ZT 2.0 mg/L、琼脂5 g/L的WPM (pH 5.8)上，每瓶培养基40 mL、10个茎段。经7 d暗培养后转于培养室培养，培养温度(25±2) ℃，光照强度30～50 μmol/(m2·s)，每天光照12 h，培养60 d后用作下一次继代的增殖材料。经过25次继代增殖达到试验所需组培苗量后，选取生长良好、长势基本一致的幼嫩樟叶越桔组培苗用于愈伤组织诱导试验。

1.2.2 不同激素及其质量浓度对樟叶越桔茎段愈伤组织诱导的影响

将樟叶越桔组培苗置于超净工作台上，去除叶片，取中部茎段，切成长为2～3 cm、带3个节点的茎段，并在茎段上划3～4个伤口，有伤口处朝上平行接种于添加不同质量浓度2,4-D和TDZ的愈伤组织诱导培养基 (WPM +蔗糖30 g/L+琼脂5 g/L) 上，采用L9(32)正交试验设置2因素9组合正交试验激素配比(表1)。每个处理组接种30瓶，每瓶2根茎段。先进行7 d暗培养处理，之后转到培养室培养，培养条件同1.2.1节。每天观察其生长情况，于30 d时统计愈伤组织诱导率、外植体污染率、愈伤组织量和愈伤组织质地等指标。

表1 樟叶越桔茎段愈伤组织诱导正交试验Tab.1 The orthogonal test of callus induction hormone combination of Vaccinium dunalianum mg/L

1.2.3 不同细胞分裂素及其质量浓度对愈伤组织再分化不定根的影响

将1.2.2节中获得的最优愈伤组织用手术刀从外植体上轻轻剥离，尽量不损伤愈伤组织，切成直径约1 cm的块状，分别接种于不同质量浓度TDZ和ZT (表2)的愈伤组织再分化培养基 (WPM +蔗糖30 g/L+琼脂5 g/L) 上。每个处理组接种20瓶，每瓶接种5块愈伤组织。先进行7 d暗培养，之后转于培养室培养，培养条件同1.2.1节。于60 d时观察并统计愈伤组织再分化不定根情况。

表2 愈伤组织再分化诱导激素及其质量浓度Tab.2 Hormone and its concentration induced by callus redifferentiation mg/L

1.2.4 数据统计与分析

数据采用Excel统计，并根据以下公式计算愈伤组织诱导率和愈伤组织再分化诱导率。

愈伤组织诱导率=(形成愈伤组织的外植体数/接种的总外植体数)×100%；

愈伤组织再分化诱导率=(再分化的愈伤组织数/接种的总愈伤组织数)×100%。

根据愈伤组织生长情况和愈伤组织量的多少，将愈伤组织量描述为少、一般、较多和旺盛4个等级，分别记为“+”“++”“+++”和“++++”。

2 结果与分析

2.1 樟叶越桔组培苗的继代增殖

如图1所示：樟叶越桔组培苗在增殖培养基上生长约30 d时可明显观察到幼嫩腋芽萌发；随着培养时间的延长，腋芽数量增加，形成较多分支；当培养到90 d时，组培苗生长旺盛，侧枝多，颜色浓绿，平均高度可达5～7 cm，可满足后续茎段愈伤组织诱导的供试材料要求。

图1 供试樟叶越桔材料的继代增殖培养Fig.1 Subculture and multiplication culture of test Vaccinium dunalianum material

2.2 不同激素配比对愈伤组织诱导的影响

由表3和图2可知：2,4-D和TDZ的9组不同质量浓度组合配比处理均可先后成功诱导樟叶越桔茎段长出愈伤组织，但试验诱导愈伤组织的初愈伤时间和愈伤组织质地存在一定差异。培养7 d后观察到各处理组的茎段普遍增大变粗趋于透明状；T4组茎段于培养12 d时诱导长出小颗粒愈伤组织，T5～T9组茎段在培养15 d时诱导出愈伤组织，T1～T3组茎段诱导出愈伤组织的时间最长，为20 d。培养至30 d时，T1和T2组茎段诱导率较高，分别为90.0%和93.3%，但愈伤组织量一般，无明显差异。T3组诱导率为76.7%，愈伤组织效果较差。T4～T6组诱导的乳白色愈伤组织生长迅速，鲜活，质地紧实，长势好；其中，T4组诱导率达100.0%，且愈伤组织量旺盛；T5组诱导率为90.0%，愈伤组织量较多；而T6组诱导率低至73.3%。T7～T9组诱导的乳白色愈伤组织虽然鲜活，但质地疏松且长势缓慢；其中，T7组诱导率较低，为76.7%；T8和T9组虽然诱导率较高(分别为100.0%和93.3%)，但生长缓慢且质地不理想。表明2,4-D质量浓度越高，愈伤组织质地越趋于疏松；质量浓度越低，愈伤组织质地越紧实。另外，随着培养时间的延长，后期观测到随着TDZ质量浓度的增加，愈伤组织越趋于褐化且程度加深。因此，2,4-D 2.0 mg/L+TDZ 0.1 mg/L (T4组)是樟叶越桔茎段愈伤组织诱导的最佳激素组合。此外，培养60 d 时T4组愈伤组织质地为乳白色大颗粒、紧实、鲜活，相较于其他处理组仍长势最好，因此，将T4组的愈伤组织作为后续不定根再生的供试材料。

图2 不同激素配比下愈伤组织的生长 (30 d)Fig.2 Growth of callus under different hormones ratio

表3 不同激素配比对愈伤组织诱导的影响Tab.3 Effects of different hormone ratio on the callus induction of stem

2.3 不同细胞分裂素及其质量浓度对愈伤组织再分化不定根的影响

愈伤组织在各组再分化培养基中培养14 d后，乳白色愈伤组织普遍开始转变为嫩绿色，随着培养时间延长到约40 d时，愈伤组织表面开始产生一定数量的不定根。再随着培养时间增加到60 d时(表4、图3)，T10组不定根萌发率最高，可达96.7%，不定根较长、量较多且整齐均匀；T11组效果次之，不定根萌发率为66.7%，不定根数量中等且不均匀；T12组不定根萌发率最差，仅为46.7%，不定根数量较少且短。说明随着TDZ质量浓度的增加，不定根萌发率和生长逐渐受到抑制。此外，T15组的不定根萌发率最高，为76.7%，量多但不均匀；T14组效果次之，不定根的萌发率为53.3%；T13组的不定根萌发率效果最差，仅为36.7%，量少、稀疏且不均匀。说明随着ZT的质量浓度越大，不定根的萌发率越高且数量越多。以上结果表明：TDZ对樟叶越桔愈伤组织再分化不定根的促进作用显著优于ZT，且质量浓度为0.5 mg/L时效果较好。

图3 不同质量浓度细胞分裂素下愈伤组织再分化不定根的生长 (60 d)Fig.3 Growth of callus redifferentiation adventitious root under different concentrations of cytokinin

表4 不同质量浓度细胞分裂素对愈伤组织再分化不定根的影响Tab.4 Effects of different mass concentrations of cytokinin on the callus redifferentiation adventitious root

3 讨论

本研究以樟叶越桔幼嫩茎段为外植体，试验发现其愈伤组织诱导最佳培养基及配方为：WPM +2,4-D 2.0 mg/L+TDZ 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂5 g/L，愈伤组织诱导率高达100%，乳白色颗粒，质地紧密，鲜活且生长旺盛，无褐化现象产生。愈伤组织在再分化培养基(WPM+TDZ 0.5 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂5 g/L)上，不定根诱导率达96.7%，根较长，量较多，整齐，均匀。MEINERS等[20]以越桔茎段为外植体，发现WPM培养基比Anderson和MS培养基更适合越桔属植物的组织培养。SEDLAK等[25]以高丛蓝莓为试验材料的研究结果也说明WPM培养基更适合越桔属植物组织培养的结论，所以本研究优先选用WPM为基本培养基。

植物生长调节剂的使用在很大程度上决定着愈伤组织诱导的效率、愈伤组织胚性及其分化方向[26]。本研究选择不同质量浓度的2,4-D对樟叶越桔茎段愈伤组织进行诱导发现：当2,4-D质量浓度为2.0 mg/L时，诱导率可达到100%。这一结果与白刺花(Sophoradavidii)胚性愈伤组织诱导结果[26]一致。一般认为高质量浓度的生长素有利于愈伤组织的生长，且2,4-D的诱导效果优于萘乙酸、吲哚乙酸和吲哚丁酸等[27-29]。但当2,4-D质量浓度过高或过低时愈伤组织的生长和分化会受到严重影响，不利于外植体间接芽再生后期不定芽的分化[21]，且愈伤组织长期生长于含2,4-D的培养基上会逐渐丧失其胚性，极大地限制愈伤组织进一步分化出芽的能力[26]。TDZ是一种新型人工合成的高效细胞分裂素类植物激素[30]，对组织培养的效果因其质量浓度存在较大差异。本研究发现低质量浓度的TDZ更有利于樟叶越桔茎段愈伤组织的发生，这一结果与KARAKAS[16]对枸杞愈伤组织诱导的研究结果相符。愈伤组织用途众多，不仅是细胞原生质体培养的原材料来源[31]，还常用于工农业和医药生产中无性系的筛选以及重要次生代谢化合物的大规模生产[32]。此外，不同部位诱导形成的愈伤组织，其次生代谢物含量会存在差别[33]。本研究以樟叶越桔茎段为外植体建立愈伤组织诱导体系，为后续进行不同部位愈伤组织合成次生代谢物能力比较奠定了基础；同时，也为开展愈伤组织合成次生代谢物的研究与应用提供了材料参考，并对日益匮乏的樟叶越桔植物种质资源保存、品种改良及遗传育种工作具有重要意义。

不定根在重要次生代谢产物生产与植物营养等方面具有重要意义[13-15]。由于次生代谢物通常由专门的细胞或在不同的发育阶段才能合成，而未分化的植物细胞培养物通常会部分或全部丧失积累次生产物的能力[34]。因此，通过诱导不定根获得次生代谢物也是一种重要的生物技术手段，不定根在培养过程中比细胞系更稳定，且次生代谢物的合成能力更强[35-36]。本研究建立了以愈伤组织为材料分化不定根的技术体系，在愈伤组织再分化诱导阶段中发现：在不同种类的单一细胞分裂素作用下，愈伤组织的再分化程度存在差异。在TDZ作用下，不定根诱导率最高达96.7%，而在ZT作用下诱导率与前者相比降低20%，可见，TDZ在促进樟叶越桔愈伤组织再分化不定根阶段中效果更佳。与以樟叶越桔组培苗叶片为外植体的不定根形成技术体系[22]相比，愈伤组织因质地均一、分化能力强，诱导获得的不定根数量更多、长度更长、质量更佳，还解决了因个别叶片效果差异所导致的不定根相对平均偏差较大[22]的问题。因此，本研究为实现利用樟叶越桔不定根植物生物反应器生产熊果苷和6′-O-咖啡酰熊果苷等重要次生代谢化合物提供了稳定的材料来源。

有研究表明：TDZ在越桔[20]和高丛蓝莓[37]等越桔属植物中具有显著的促进不定芽再生作用。在一定质量浓度范围内，提高TDZ的质量浓度可提高外植体不定芽的数量，但会抑制不定芽节间的伸长；降低其质量浓度有助于节间伸长但不定芽数量减少[21,38]。本研究发现：樟叶越桔愈伤组织可直接再分化出大量不定根，这一现象与谭亚婷等[39]的研究一致，而与其他越桔属植物愈伤组织再分化诱导易出芽[40]相反，说明樟叶越桔愈伤组织易分化不定根，但不易出芽。这给以樟叶越桔愈伤组织为材料的遗传转化体系建立带来了困难。推测愈伤组织再分化不易出芽的原因主要有：(1) 尽管2,4-D具有显著的促进愈伤组织生成的能力，但在某些物种愈伤组织再分化不定芽后期具有抑制作用[21]；(2) 2,4-D的作用具有阶段性，愈伤组织在含2,4-D的培养基上生长一段时间后会丧失再分化不定芽的能力[26]；(3) 愈伤组织再分化不定芽阶段不仅需要细胞分裂素的调节，也需要生长素的参与[41]。针对樟叶越桔愈伤组织再分化不定芽过程中存在的问题，需要在后续研究中进行更深入的探索，如培养条件的优化、外源激素种类的选择与配比的合理使用等。

4 结论

本研究建立了樟叶越桔以茎段为外植体的愈伤组织诱导体系，诱导出的愈伤组织呈乳白色且诱导率理想，愈伤组织再分化阶段获得大量不定根，数量多、较长且均匀，愈伤组织和不定根在培养过程中比细胞系更稳定。因此，通过诱导愈伤组织和不定根再生来获得重要次生代谢产物也是一种重要的生物技术手段，这为樟叶越桔在工业水平生产重要次生代谢产物提供了可行性。