不同种(品种)金鸡菊的染色体数目鉴定及核型分析

孙浩男, 李明阳, 刘冬云*, 王 鑫, 田 琳, 吴芳芳

(1. 河北农业大学园林与旅游学院, 河北 保定 071000；2. 河北省涉县城镇园林管理所, 河北 邯郸 056400)

菊科(Compositae)金鸡菊属(CoreopsisLinn.)植物大多为一年生和多年生草本，也有亚灌木和灌木，主要原产于北美洲和南美洲，我国习见栽培7种[1]。有报道称，中国最早于1936～1938年期间由国外引入剑叶金鸡菊(C.lanceolata)作为观赏植物，其余物种暂无确切的引入记录，但在20世纪20年代，我国就有了大花金鸡菊(C.grandiflora)及两色金鸡菊(C.tinctoria)的栽培记录[2-4]。金鸡菊成景效果好，观赏价值高，是出色的蜜源植物，大部分金鸡菊对寒冷、炎热的气候具有较好的抗性，且能够适应不良的土壤环境，因此可以广泛应用于公园、校园、铁路及街道景观等[5-6]。鉴于其出色的适应性和观赏性，美国国家园林局还将2018年定为“金鸡菊年”(Year of the Coreopsis)。此外，金鸡菊在药用价值及经济价值方面也具有极大的潜力[7]。

核型分析是研究物种染色体遗传特征的方法之一，对植物的核形态进行研究，也可为植物品种间的形成和演化关系提供一定的遗传学证据[8-9]。金鸡菊的遗传多样性丰富，前人已对金鸡菊的染色体做了部分研究，主要涉及大量北美的野生种及少量引入我国的物种，其中野生种染色体基数、倍性及数目多变，而我国栽培的大花金鸡菊及两色金鸡菊在染色体数目以及核型方面也有明显的不同[10-13]。常见的金鸡菊花色以黄色为主，也有个别粉色及复色的野生种，近年来，育种家Prost、Korlipara及Hansen等人通过不断杂交培育了一系列花色丰富的金鸡菊品种，颜色包括白色、变色及多种复色，亲本主要包括两色金鸡菊、玫红金鸡菊(C.rosea)、大花金鸡菊、剑叶金鸡菊、耳叶金鸡菊(C.auriculata)、短毛金鸡菊(C.pubescens)、轮叶金鸡菊(C.verticillata)、‘甜梦’(C.rosea‘Sweet Dream’)等[14-15]。

金鸡菊育种发展时间较短，其栽培品种的育种背景较为复杂，大部分涉及了远缘杂交，栽培金鸡菊的主要育种亲本在染色体基数上存在一定差距，如大花金鸡菊为x=13，两色金鸡菊为x=12，短毛金鸡菊为x=14等[11]，报道主要集中在野生种上，而有关栽培金鸡菊及杂交品种方面更是鲜有细胞学方面的研究报导，因此，明确其核型特征及染色体数目有助于金鸡菊种质资源的开发和利用。本研究选取课题组收集自各国的金鸡菊资源共60份，采用常规压片法进行染色体数目鉴定，并对其中的18个籽播系材料进行染色体核型分析，旨在为金鸡菊的分类、鉴定、遗传变异及杂交育种等方面提供更多细胞学方面的参考。

1 材料与方法

用于染色体数目鉴定的材料由课题组提供，主要收集自中国、美国、英国、德国、日本和韩国等国家，包含共60个不同类型的野生种及园艺品种(表1)，列表前24个序号的材料是国内外常见栽培的籽播型金鸡菊，CGL01、CGL02、CGL03、CG-WS、CG-YFC是国内常见标注为大花金鸡菊的籽播型材料，列表中剩余材料均为无性系金鸡菊。用于核型分析的材料包括列表中前16个序号和CG-WS、CG-YFC。在分类学上，金鬃金鸡菊、大花金鸡菊、剑叶金鸡菊、耳叶金鸡菊、短毛金鸡菊、皇冠金鸡菊属于金鸡菊组(C.sect.Coreopsis)；大叶金鸡菊，三叶金鸡菊，掌叶金鸡菊，轮叶金鸡菊属于轮叶组(C.sect.Gyrophyllum)、两色金鸡菊和细叶金鸡菊属于两色组(C.sect.Calliopsis)、玫红金鸡菊属于歧序组(C.sect.Eublepharis)，沙漠金鸡菊属于异果组(C.sect.Pugiopappus)。

表1 供试金鸡菊的基本信息Table 1 The information of tested the Corepsis L.

续表1

根尖萌发培养实验在河北农业大学园林智能温室中进行。分别在各个籽播型材料中挑选颗粒饱满的种子点播在潮湿的基质(细草炭∶珍珠岩=1∶1)表面并做好标记，不做覆土，每天观察补水，待瘦果开裂露白的第二天上午选取根长1～2 cm的种子进行取材；无性系材料选取顶生两节枝条，使用相同基质进行扦插，生根后进行取材，每种金鸡菊各取15个根尖，3次重复。根尖用蒸馏水冲洗干净，整个过程轻柔小心，以免破坏其根尖部位，参考王琪琪两色金鸡菊的染色体制片方法[13]并加以改良：进行冰水混合物预处理24 h；卡诺氏固定液(V无水乙醇∶V冰醋酸=3∶1)在4℃冰箱中固定20～24 h；1 mol·L-1稀盐酸在60℃水浴中解离7～8 min；切取根尖于载玻片中央轻压，用改良卡宝品红染色15 min以上后正常压片，成片在徕卡DM 4000显微镜下观察拍照(100倍油镜)。

每种材料观察至少50个以上有丝分裂中期相的细胞，细胞染色体计数以80%具有一致的染色体数目作为标准，核型分析参考李懋学等[16]的方法，核型类型分析参照Stebbins[17]的标准进行，核型不对称系数按照Arano[18]的方法计算，使用Photoshop 2018和Excel 2010进行染色体配对，并制作染色体数目分布柱状图，参照孙桂芳等[19]的方法制作核型坐标图。

2 结果与分析

2.1 染色体数目统计

通过镜检观察，60个材料的染色体数目稳定，共有12种类型(表1，表2，图1)，26条染色体类型的材料最多，共有23个，占总数的38.33%，其次为24条染色体的类型，共有10个，占总数的16.67%。而20,28,48,52条染色体类型的材料最少，只有1个。

29个籽播系的染色体数目以26条和24条类型为主，分别有18个和8个，占籽播系材料的62.07%和27.59%。染色体基数存在4种，金鸡菊组染色体基数种类最多，有x=10,13,14三种，轮叶组和歧序组的材料染色体基数只有x=13一种，两色组和异果组的材料染色体基数只有x=12。其中，皇冠金鸡菊2n=2x=20，两色金鸡菊、细叶金鸡菊和沙漠金鸡菊2n=2x=24，短毛金鸡菊2n=2x=28，大花金鸡菊‘黄金分割’2n=2x=52，其余籽播系的染色体数目为2n=2x=26。

31个无性系的染色体数目类型较多，存在24,25,26,37,38,39,44,48,50共9种，以37和25条为主，材料分别有8个和6个，占无性系材料的25.81%和19.35%。玫红金鸡菊的三个品种存在两种染色体数目，‘美国梦’为26条，‘甜梦’和‘天堂之门’为38条，轮叶金鸡菊的两个品种也存在两种染色体数目，‘月光’为26条，‘黄金雨’为39条。几个同系列品种的染色体数目一致，如Pie系列为37条，Lemonade系列和Uri Dream为25条，Coloropsis系列为24条；同一父母本组合的杂交后代及变异品种也具有相同的染色体数目，如‘雪莓’‘秋之诗韵’‘金块’和‘蔓越莓沙冰’为37条，而‘中央舞台’‘精彩表演’和‘条纹飞溅’为50条。部分同系列品种的染色体数目具有一定变化，如Big Bang系列、Little Bang系列和Fairy系列。

图1 供试金鸡菊的有丝分裂中期染色体续Fig.1 Mitotic chromosomes at metaphase of the tested Coreopsis L. Continue

表2 不同染色体数目的两种材料数量和占比Table 2 Two types materials and its percentage with different chromosome numbers

2.2 染色体核型分析

根据同源染色体配对，18个材料均可配成二倍体，染色体类型共包含s，sm，st三种(表2)。‘雪菊’、‘轮盘’、‘不可思议矮生型’三个材料都含有一对st(近端部着丝点)型染色体。18个材料均包含s(中部着丝点)，sm(近中部着丝点)两种类型的染色体，数量不等，玫红金鸡菊的s型最多，sm型最少，分别为有22条和4条。而沙漠金鸡菊的s型最少，sm型最多，分别为6条和18条。大花金鸡菊、剑叶金鸡菊和耳叶金鸡菊的核型公式相同，为2n=2x=16m+10sm，与同组的短毛金鸡菊和皇冠金鸡菊核型公式不同。轮叶组的三个材料中，大叶金鸡菊和三叶金鸡菊核型公式同为2n=2x=14m+12sm，而掌叶金鸡菊为2n=2x=18m+8sm。两色组的四个材料共发现两种核型公式，‘雪菊’和‘红色小矮人’为2n=2x=14m+8sm+2st，‘轮盘’和细叶核型公式为2n=2x=14m+10sm。

有6种材料含有随体，随体数量2至6条不等，随体所在染色体序号为，鬃毛金鸡菊的第5,7,13号染色体、'轮盘'的第10号染色体、皇冠金鸡菊的3,4,10号染色体、细叶金鸡菊的第9号染色体、沙漠金鸡菊的第4,12号染色体，CGL02的第8号染色体。所有材料中均未发现B染色体。18个材料核型全部为2A型，类型单一。核型不对称系数上，玫红金鸡菊最低，第二低的为大花金鸡菊，分别为58.56%和59.47%，最高的是沙漠金鸡菊64.93%，其次为鬃毛金鸡菊63.70%，根据核型散点图(图4)，一年生金鸡菊的不对称系数普遍高于多年生材料。玫红的平均臂比最低，为1.47，而沙漠1.92为最高，除鬃毛外，其余一年生金鸡菊的平均臂比均高于多年生金鸡菊。

CGL02和CG-YFC的核型公式为2n=2x=14m+12sm，与大花金鸡菊和剑叶金鸡菊存在一定差异。两者在核型坐标图中与剑叶距离相近，与大花金鸡菊较远，且在臂比大于2的染色体比例上，两者与剑叶金鸡菊相同为15.38%。

3 讨论

同一物种或品种的植物往往具有较为稳定的染色体数目，了解亲本及后代的染色体特征，有助于选配杂交亲本及鉴定后代，也可提高杂交育种的成功率[20-21]。北美金鸡菊野生属内染色体基数多变，并与属内分组有一定关联，如两色组为x=12，毛果组(C.sect.Pseudoagarista)为x=13，金鸡菊组甚至存在x=14,13,10,9,7,6[10-11,22-23]。在我国对两色金鸡菊的研究中，多将其称为蛇目菊，与菊科蛇目菊属的蛇目菊(Sanvitaliaprocumbens)同名，但蛇目菊属(SanvitaliaLam.)的染色体基数为x=8,11[24]，明显区别于两色金鸡菊的x=12，可由此作为两者细胞学鉴定和区分的依据。根据前人的研究，皇冠金鸡菊存在x=6,7,8,9,10五种染色体基数，部分人认为其中x=9,10的类型应立为新种类皇冠金鸡菊C.nuecensoides[23]，本次核型试验的皇冠金鸡菊仅发现x=10一种染色体基数，虽有学者不承认这一物种，但其表观形态和染色体基数更接近Crawford和Smith[25]所描述的新种。

栽培金鸡菊的育种常涉及到大量的种间杂交，目前虽有几个重要亲本染色体基数方面的报道，但未见有关栽培金鸡菊染色体倍性方面的研究。29个籽播系材料大多为二倍体，仅大花金鸡菊‘黄金分割’有52条染色体，推断其可能为四倍体，而31个无性系材料中存在大量以二倍体、三倍体及四倍体为基础的非整倍体，但部分未参与远缘杂交的品种如轮叶金鸡菊‘黄金雨’的39条染色体可能为x=13的三倍体。‘甜梦’源于一家苗圃的偶然发现，并非经过人工培育得来，商业上将其归为玫红金鸡菊，其38条染色体与玫红金鸡菊的x=13明显不同，结合其形态特征推断，其很可能产生了天然的种间杂交引入了x=12的两色组金鸡菊的基因，但也可能是玫红金鸡菊自身产生了某种染色体级变异而形成了非整倍体。但仅凭染色体数目来推测栽培金鸡菊的染色体倍性还存在较大的局限性，需要进一步辅以流式细胞仪技术和FISH技术(荧光原位杂交Fluorescence in situ hybridization)等明确染色体组大小和部分相关染色体的对应关系。

图2 十八个金鸡菊材料的核型散点图Fig.2 Karyotype coordinate image of eighteen tested Coreopsis L.

染色体通常由对称向不对称演化，表现为不对称系数的提高[26]，金鸡菊的进化趋势为生活习性上由多年生转向一年生，叶片由全缘转向全裂[2]，从核型上看，18个金鸡菊试材全部为2A型，整体上较为原始，但一年生的金鸡菊普遍具有更高的不对称系数，比多年生的更为进化。Archibald等[28]认为，一年生金鸡菊种内的染色体重组更为频繁，生殖隔离的进化速率也更快，可能由此导致了一年生金鸡菊的核型不对称系数高于多年生。和现有报道对比，大花金鸡菊的核型和杨德奎的1A型不一致[12]，两色金鸡菊三个品种的2A型与前人的报道相同，但核型公式有所出入[13,26,29]，这可能和材料来源有关，但也可能是由于材料处理时染色体缩短程度、观察和测量染色体的方法不同导致的。

杂交育种可以结合两个或多个种的优良特性，创造新的花卉种质[30]。在籽播型金鸡菊中，常用到的并非大花金鸡菊或剑叶金鸡菊其中的某一个种，而是两者的种间杂交种，为了培育植株更为矮小紧凑的品种，往往还会加入耳叶金鸡菊作为亲本[31]。三者在分类上同属金鸡菊组，本次核型试验三者试材的核型公式同为2n=2x=16m+10sm，在核型坐标图中位置也较为紧密，亲缘关系较近。我国商业上常见将金鬃金鸡菊、大花金鸡菊和剑叶金鸡菊混为一谈，在培育过程中发现，CGL02和CG-YFC的表观形态和习性与剑叶金鸡菊极为接近，根据核型坐标图和各核型参数，两者与剑叶金鸡菊更为相似，而2n=2x=14m+12sm极有可能是剑叶金鸡菊的另一种核型公式，但仍需辅以其他标记手段进行验证。籽播系金鸡菊中，大花金鸡菊和剑叶金鸡菊的染色体基数都是x=13，品种也呈2n=26或2n=52，不能仅以此为依据进行鉴别，两者的核型和染色体数目虽然相同，但核型不对称系数存在较大差异，而二者的种间杂交品种是否也在核型参数上存在差异还有待近一步研究。无性系金鸡菊中，源于同一亲本杂交组合的几个材料染色体数目的一致性可能与其亲本产生可育配子的染色体数目较为固定有关。辐射变异通常伴随着遗传物质的改变，但较少引起染色体数目的变化[32]。通过伽马射线辐射诱变得到的Uri Dream系列[33]中，‘日落梦想’和‘胭脂梦想’具有一致的染色体数目2n=25。‘天堂之门’是‘甜梦’的芽变品种[34]，而‘金块’和‘蔓越莓沙冰’起源于‘雪莓’的组培突变和二次突变[35]，这些品种在变异后也均未发生染色体数目的改变。

4 结论

本研究首次报道了大量栽培金鸡菊资源的染色体数目和核型特征，其染色体数目变化广泛，介于20～52之间，共有12种类型。籽播系材料有二倍体和四倍体，无性系材料中可能含有大量的非整倍体。染色体类型以s型和sm型为主，部分材料含有st型染色体。核型全部为2A，较为原始，个别材料的染色体含有随体，不对称系数介于58.56%～64.93%之间，而一年生金鸡菊普遍具有更高的不对称系数更为进化。亲本复杂的染色体基数及染色体倍性是造成栽培金鸡菊染色体数目多变且产生大量非整倍体的主要原因。研究结果为栽培金鸡菊的分类、鉴定、遗传变异及杂交育种等方面提供更多细胞学方面的参考。