钝顶螺旋藻耐Cd性能及其生理响应

彭 方，胡 超

(湖北工程学院 生命科学技术学院，湖北 孝感 432000)

钝顶螺旋藻(Spirulinaplatensis)属蓝藻门，丝状藻，藻丝宽4 ～5 μm，长400 ～ 600 μm，易附着在基质上形成生物膜体系，有利于污水的分离。有研究报道[5-6]，钝顶螺旋藻对污水中的氮磷具有较强的去除能力，并对水体中Cd2+表现出较强的吸附和富集能力。这表明其可能在利用污水中氮、磷等营养物质生长的同时有效地去除污水中的重金属，对处理复合污水具有较好的潜力[7-9]。虽然国内外大量研究从抗氧化层面研究了微藻对重金属胁迫的响应，但缺乏响应机理的生理学层面分析，这使钝顶螺旋藻在水处理和水污染修复领域的应用受到限制。系统研究钝顶螺旋藻的耐Cd特性及其生理响应可为响应机理的研究提供重要参考。

本文研究钝顶螺旋藻在不同浓度镉离子胁迫下，细胞生长、形态、可溶性蛋白含量及抗氧化酶活性的变化，探讨其对重金属镉的耐受性，旨在为进一步处理含重金属的废水提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

钝顶螺旋藻(Spirulinaplatensis)购自中国科学院武汉水生生物研究所国家淡水藻种库(FACHB)，用CdCl2(分析纯)配置1.0 g/L的Cd2+储备液。

采用Zarrok培养基[10]。藻细胞经超纯水清洗3次，在无菌的条件下用接种环将藻细胞接种于含培养基的三角瓶中，混匀，在温度25±1 ℃，光照强度2500 Lux，光暗比为12:12的条件下培养，每天定时摇瓶3次。培养基使用前需经高压蒸汽灭菌锅灭菌(121 ℃，0.5 h)处理，冷却至室温后用1.0 mol/L、0.1 mol/L和0.01 mol/L NaOH或HCl调节pH为9.0±0.1。

1.2 实验方法

1.2.1 钝顶螺旋藻毒性实验

取适量对数生长期的钝顶螺旋藻藻液过滤，并用超纯水清洗3次，收集藻细胞，将藻细胞接种到不同浓度重金属培养液中振荡培养。根据预实验的结果，设定Cd2+的浓度分别为0、5、10、20、40、80 mg/L，初始藻生物量取OD560=0.1(干重浓度0.1 g/L)，控制培养条件一致，实验周期为4 d，每天定时取样测定生物量浓度。每个梯度设定3个平行，结果取平均值。

1.2.2 蛋白质及酶活性的测定

取培养96 h后的藻液15 mL置于25 mL离心管中离心(4000 r/min，10 min)，弃去上清液，然后加入15 mL超纯水后离心洗涤，重复3次后弃去上清液，改加15 mL磷酸盐缓冲液(pH=7.2)，于冰浴中超声破碎10 min(采用SZ-ⅡD型超声波细胞粉粹机，其间工作3 s，间歇2 s)，离心(4 ℃，10000 r/min，15 min)收集上清液，保存于冰箱中待测。可溶性蛋白质含量的测定采用考马斯亮蓝法，超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)活性的测定采用试剂盒直接测定(试剂盒购于南京建成生物工程研究所)。所有酶比活以每毫克蛋白计。

1.2.3 藻细胞的形态观察

取培养96 h后的藻液15 mL置于25 mL离心管中离心(4000 r/min，10 min)，弃去上清液，然后加入15 mL超纯水后离心洗涤，重复3次后弃去上清液，收集藻细胞备用。利用扫描电镜(SEM)观察藻细胞形态。

1.3 数据分析

藻细胞生长抑制率用式(1)计算：

X%=(I0-I)/I0×100%

(1)

式中:X为细胞生长抑制率，I0为对照组，I为实验组。利用Logistic曲线拟合抑制率，计算出Cd2+的96 h-EC 50值。

2 结果与讨论

2.1 不同Cd2+浓度对钝顶螺旋藻生长的影响

不同浓度重金属镉连续暴露4 d后，钝顶螺旋藻的生长曲线和干重如图1所示。从图1可以看出，较低浓度(5 ～ 20 mg/L)的Cd2+对钝顶螺旋藻的生长表现出一定程度的促进作用，最大促进作用分别为11.9%、12.9%和5.1%；随着溶液中Cd2+浓度的增大，钝顶螺旋藻的生长又会受到抑制，并且重金属浓度越大，藻细胞生长受到的抑制作用越强，Cd2+对钝顶螺旋藻的96 h-EC 50为38.3 mg/L。

图1 不同浓度Cd2+对钝顶螺旋藻生长曲线(a)及生物量(b)的影响

钝顶螺旋藻的藻密度和干重值越大，藻丝越完好无损，说明其生长得越好。在电镜下观察钝顶螺旋藻在不同浓度Cd2+暴露下的形态变化，结果如图2所示。正常对照组中(图2A、图2D)，藻丝形状呈规则的螺旋卷曲状，藻体较长，完好无断裂，藻体顶端细胞钝圆，藻细胞饱满光滑；在低Cd2+浓度下(5 ～ 20 mg/L)，藻丝形状发生畸变，部分呈螺旋，出现断藻现象，藻细胞出现一定程度的干瘪(图2B、图2E)；而高浓度处理(Cd2+> 20 mg/L)则断裂现象严重，已无法观察到完整的螺旋形藻丝，均为断裂碎片，藻体表面褶皱加深(图2C、图2F)。以上结果表明，低浓度Cd2+对钝顶螺旋藻的生长表现出一定的促进作用，对藻细胞的形态存在影响；高浓度Cd2+对藻的生长表现出明显的抑制和损伤作用。

A-C：1000倍；D-F：15000倍图2 Cd2+胁迫下钝顶螺旋藻电镜图片

2.2 不同Cd2+浓度对钝顶螺旋藻中可溶性蛋白的影响

可溶性蛋白大多数是功能蛋白和参与各种代谢的酶类，是植物适应环境、增强抗逆性的基础，因此可作为衡量植物代谢水平的重要指标[3,11-12]。不同浓度Cd2+暴露下，藻细胞中可溶性蛋白的含量如图3所示，随着Cd2+浓度的增加，可溶性蛋白呈现先上升后下降的趋势。这与叶鹏浩等[13]及葸玉琴等[14]的研究结果一致。本研究中，在Cd2+浓度为5 mg/L时，可溶性蛋白浓度达到最大；当Cd2+浓度超过10 mg/L时，可溶性蛋白浓度显著降低。其主要原因是较低浓度的Cd2+能诱导钝顶螺旋藻产生可溶性蛋白以减轻自身的伤害，但随着Cd2+浓度和处理时间的增加，被藻体吸收的Cd2+与-SH基结合导致蛋白变性，也可能是Cd2+取代了酶蛋白的活性中心，影响了酶的活性，导致蛋白质合成受阻，从而降低了藻细胞中可溶性蛋白的含量[3,12]。

2.3 不同Cd2+浓度对钝顶螺旋藻中抗氧化酶活性的影响

在重金属胁迫下，植物体内会产生大量的活性氧自由基，通常情况下，植物体内的抗氧化防御系统会通过清除自由以维持体内环境的相对稳定，一旦超过植物自我清除的能力，这些自由基会与脂质、蛋白质、核酸等物质发生反应，引起脂质过氧化、膜损伤和酶失活，从而影响细胞的性能和生存能力，甚至导致植物死亡[15-17]。

图3 不同浓度Cd2+对钝顶螺旋藻中可溶性蛋白的影响

SOD 是植物体内的重要保护酶，能够通过歧化反应有效地将活性较强的超氧自由基(O2-)转化为活性较弱的H2O2，而POD、CAT可以清除细胞内的H2O2，进而防止O2-与H2O2生成活性更强的羟基自由基(OH·)[18]。不同Cd2+浓度下，钝顶螺旋藻中抗氧化酶活性影响如图4、图5、图6所示。相对于对照组(无Cd2+添加)，Cd2+胁迫下，钝顶螺旋藻中的SOD、POD和CAT活性均有提高，且在Cd2+浓度为20 mg/L时，3种酶的活性达到最大；随着重金属Cd2+浓度增加，3种酶的活性均表现出“低促高抑”的现象。这表明Cd2+胁迫能促使钝顶螺旋藻抗氧化系统产生应激反应，清除体内过多的自由基而保持相对活性，且在低浓度Cd2+条件下，应激反应更显著；然而高浓度(>20 mg/L)使藻体的正常代谢受到影响甚至遭到破坏，抑制了抗氧化系统反应能力，导致抗氧化酶活性显著下降。

图4 不同浓度Cd2+对钝顶螺旋藻中SOD活性的影响

图5 不同浓度Cd2+对钝顶螺旋藻中POD活性的影响

图6 不同浓度Cd2+对钝顶螺旋藻中CAT活性的影响

3 结论

虽然重金属镉对钝顶螺旋藻有一定的毒害作用，但在低浓度的镉(低于20 mg/L)胁迫下，钝顶螺旋藻可调节藻细胞内可溶性蛋白含量及抗氧化酶(SOD、POD及CAT)活性来抵御外界重金属的毒害作用以保证其正常生长；钝顶螺旋藻对低浓度镉具有良好的适应性和耐受性，可为钝顶螺旋藻应用于污水处理提供一定的理论参考。