重金属铜胁迫对油菜幼苗生长和铜累积的影响

王立凯，朱震昊，温 馨,2*，刘孜琪，周诗怡，王乐钦

(1.湖北工程学院 生命科学技术学院，湖北 孝感 432000； 2.湖北工程学院 特色果蔬质量安全控制湖北省重点实验室，湖北 孝感 432000)

铜是高等植物必需的17种营养元素之一，是植物体内多种氧化酶的组成成分，在氧化还原反应、叶绿素合成中有重要作用，但铜在土壤中容易积累，当铜含量超过一定阈值时会对植物造成毒害作用，干扰细胞代谢，造成植物内部紊乱，引起部分酶失活等。

我国土壤含铜量较为丰富，农业生产实践中铜缺乏现象已比较少见，但随着现代工农业的快速发展，城市工业、采矿业、居民生活导致的“三废”排放和农业生产中含铜化肥和农药的大量使用，使得土壤铜污染状况日趋严重，抑制植物、动物正常生长发育，扰乱土壤微生物平衡与健康，引起生态系统失调，带来一系列生态风险[1]。

面对严峻的农田土壤铜污染问题，物理修复、化学修复、生物修复等铜污染修复技术引起学者们的广泛关注，其中植物修复因其成本较低、适应性广、无二次污染的优点，在土壤治理方面具有良好的应用前景[2]。土壤重金属污染植物修复的基本原理是通过植物吸收作用将重金属从土壤中携出，不同植物对重金属的累积量不同，相同植物不同品种之间因存在基因型差异，对重金属的累积量也有显著的差异。超积累品种有生长速度更快、重金属累积量更大、对重金属的耐受性更强等特点，适宜种在重金属污染较为严重的地区，而低积累品种在重金属中轻度污染的土壤上种植是一个切实可行的措施。因此，进行铜高、低积累作物品种的筛选，对农田土壤铜污染的修复和治理有着重要作用。

油菜是我国重要的油料作物，菜油除供人们食用外还是重要的工业用油，其加工副产品也用于各行业生产中，在农业经济发展中具有重要的地位。油菜在我国有着悠久的栽培历史和种植经验，其产区主要分布在长江中下游平原地区，农田土壤存在不同程度的铜污染状况，以鄱阳湖为例，多年的铜矿开发、工业废水超标排放，导致鄱阳湖及附近多处油菜种植区铜污染情况严重[3]。因此，研究铜污染对油菜生长的影响，筛选出铜积累水平差异显著的油菜品种，对于修复农田土壤铜污染以及保证油菜产量品质具有重要意义。本研究通过水培试验模拟铜污染环境，研究22个油菜品种对铜的吸收和累积效果，为铜污染土壤超积累植物的筛选提供参考，评价油菜品种对铜污染土壤的修复潜能。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试油菜的品种名称、试验编号如表1所示，其中A到L来源为市场采购，A01到A12来源为孝感市农科院自留繁育。

表1 供试油菜品种名称和试验编号

1.2 试验设计

每个品种分别挑选健康饱满的种子，用0.5% NaClO溶液消毒20 min，去离子水反复清洗干净、浸种催芽24 h后，置于铺有单层纱布的培养皿中，在光照16 h、黑暗8 h，温度为25 ℃，相对湿度为65%的条件下催芽。待子叶完全展开后，挑选长势良好大小一致的幼苗，移栽于盛有10 L含营养液的避光聚乙烯盒中，先用1/4营养液培养5 d，再用1/2营养液培养5 d，然后转入全量营养液培养10 d，之后进行不同浓度铜处理。营养液组成为改良霍格兰营养液(大量元素)和无铜的阿农营养液(微量元素)，营养液配方如表2和表3所示。

试验设4个处理，即铜浓度设置为：0、20、40、60 mg/L。每品种每处理5颗幼苗为重复。不同铜浓度以CuSO4·5H2O配置。试验所用全部试剂采用分析纯，全部用水为去离子水。

表2 霍格兰营养液配方

表3 阿农微量元素营养液配方

1.3 样品采集与测定

生物量：2021年4月10日，22个油菜品种的幼苗生长茁壮，开始进行铜胁迫，胁迫7 d后，油菜幼苗出现典型的铜中毒症状，采集样品，去离子水洗净后，测定油菜幼苗单株鲜重(地上部、根部)，随后放入烘箱，105 ℃杀青30 min，70 ℃烘干至恒重。

植物组织铜含量：准确称取植物干样0.3000 g于三角瓶中，加入10 mL混酸(硝酸+高氯酸v:v=4:1)，酸解放置过夜后，用电热板消解，直至冒白烟，消化液呈无色透明或略带黄色，将消化液少量多次洗入50 mL容量瓶中，定容至刻度，过滤，滤液上原子吸收光谱仪测定，同时做样品空白和标准曲线。

采用Excel 2007对数据进行统计分析。利用SPSS 20.0 软件进行22个油菜品种同一铜处理下各指标的方差分析(Duncan法)，用K-均值聚类法进行聚类分析。

2 结果与分析

2.1 不同浓度铜胁迫对油菜幼苗生物量的影响

如图1所示，不同浓度铜胁迫对22个油菜品种幼苗生长情况的影响趋势一致，即20 mg/L处理开始，油菜出现明显的铜中毒症状，并随着铜胁迫浓度的增加而严重，中毒症状主要为：植株矮小，叶片黄化枯萎，叶脉颜色加深，根系生长受阻。

从表4可以看出，22个油菜品种幼苗的单株地上部生物量在4个铜浓度下有显著差异：其中品种B、C、H、K、A08、A09和A10聚为一类，特点是对照单株鲜重较高，随着铜浓度增加生物量明显降低；品种E、J、A02、A03、A12聚为一类，此类品种的单株鲜重在不施铜处理下虽然不是最高，但在所有铜胁迫处理中均有较高的生物量；品种A、F、G、I、L、A01、A06、A07、A11聚为一类，此类品种在不施铜处理下生物量较低，铜胁迫后生物量更低。

图1 油菜品种H、A09、G和A10的生长情况

表4 不同浓度铜胁迫下油菜幼苗的单株鲜重(地上部)

由表5可知，22个品种油菜幼苗的单株根部生物量在4个铜浓度下有显著差异：其中品种B、K、A08聚为一类，特点为对照的生物量最高，但在铜胁迫处理下生物量显著降低；品种C、E、H、J、L、A01、A02、A03、A09、A10、A12聚为一类，特点为对照的生物量低、在铜胁迫处理下高于分类3；品种A、F、G、I、A04、A06、A07、A11聚为一类，在4个铜处理中生物量均较低。

由此可知，品种B、K、A08是对铜胁迫较为敏感的品种，铜胁迫后，其生物量显著降低；品种E、J、A02、A03、A12耐受铜胁迫的能力较强。

2.2 不同浓度铜胁迫对油菜幼苗铜含量的影响

不同油菜品种对铜的吸收存在差异，且地上部铜含量随着铜胁迫水平的升高而升高。由图2可知，20 mg/L铜胁迫下，地上部铜含量范围是0.83 ～ 3.49 mg/g，差值为2.66 mg/g；40 mg/L铜胁迫下，地上部铜含量范围是1.84 ～ 3.44 mg/g，差值为1.60 mg/g；60 mg/L铜胁迫下，地上部铜含量范围是1.67 ～ 4.45 mg/g，差值为2.78 mg/g。对22个不同油菜品种的地上部铜含量进行聚类分析，将供试品种聚为3类：品种G、H、A01、A11聚为一类，此类特点是在3个铜胁迫处理中地上部铜含量均较高；品种A、B、C、E、F、I、J、L、A02、A04、A06、A09聚为一类，此类特点是3个铜胁迫处理中地上部铜含量均较低；品种A03、A07、K、A08、A10、A12聚为一类，此类特点是地上部铜含量在20 mg/L铜胁迫下较低、且随着铜水平的升高不断增加。

表5 不同浓度铜胁迫下油菜幼苗的单株鲜重(根部)

图2 不同浓度铜胁迫下油菜幼苗的地上部铜含量

由图3可知，20 mg/L铜胁迫下，根部铜含量范围是6.60 ～ 21.51 mg/g，差值为14.91 mg/g；40 mg/L铜胁迫下，根根部铜含量范围是10.03 ～ 64.52 mg/g，差值为54.49 mg/g；60 mg/L铜胁迫下，根部铜含量范围是10.69 ～ 74.75 mg/g，差值为64.06 mg/g。所有品种的油菜根部铜含量聚为一类，除L外，其他品种油菜根部铜含量在40 mg/L铜处理中最高。同时，结合油菜地上部、根部铜含量可知，60 mg/L铜胁迫加速了铜从植物根系向地上部的转移。

图3 不同浓度铜胁迫下油菜幼苗的根部铜含量

2.3 不同浓度铜胁迫对油菜幼苗铜累积量的影响

22个油菜品种地上部和根部铜累积量对不同浓度铜胁迫的响应趋势不同。由图4可知，随铜浓度的升高，品种A、E、F、H、K、A04、A06、A07、A08、A10和A12的地上部铜累积量也随之增加，在所有铜胁迫下，品种H和A10地上部铜累积量较高，尤其是在60 mg/L铜处理中，二者在所有品种中最高。

图4 不同浓度铜胁迫下油菜幼苗的地上部铜累积量

由图5可知，所有品种根部铜累积量聚为一类，即在铜胁迫下变化趋势相似，除品种L和A06，其余的20个品种根部的铜累积量在40 mg/L铜胁迫下最高。

图5 不同浓度铜胁迫下油菜幼苗的根部铜累积量

由图6可知，对22个油菜品种的铜累积总量进行分析发现，品种H、J、A01、A10、A11和A12的铜累积总量高于其他品种。

图6 不同浓度铜胁迫下油菜幼苗的总铜累积量

3 讨论

铜虽然是高等植物生长发育必需的微量元素之一，但植物对铜的忍耐力较差，铜过量很容易引起毒害作用，对一般植物来讲，体内含铜量超过20 mg/kg时就可能出现中毒症状，过量的铜会导致植物生物量减少、生长发育迟缓，甚至引起萎黄病和坏死[4-6]，本研究中，营养液铜浓度超过20 mg/L时，所有油菜品种都表现出中毒症状，且随着铜胁迫浓度的升高，大部分油菜品种表现出生物量降低、叶片黄化、叶脉颜色加深的毒害症状，这与前人研究结果一致。

不同基因型作物耐受重金属胁迫的能力不同：孙建云等[7]发现铜耐性甘蓝品种除了限制铜向地上部运输还可以通过限制根吸收铜来缓解铜的毒害，造成不同基因型甘蓝对铜吸收和累积出现显著差异；张远兵等[8]通过分析7个高羊茅品种的叶绿素和还原氯化三苯四氮唑(TTC)能力，得到不同铜浓度胁迫下不同高羊茅品种的耐性强弱不同；吴志超[9]以地上部生物量和地上部镉含量为筛选指标，从49个不同基因型油菜中筛选得到镉高积累品种中双9号、镉低积累品种白花油菜。本研究中22个油菜品种对铜胁迫的耐受力、油菜幼苗铜累积量有显著差异，所有供试品种中双油10号、华油杂9号、20EA01、20EA10、20EA11、20EA12是铜积累量较高的品种，文油99、中双10号、中油杂12、沣油737、20EA02、20EA05、20EA06、20EA07、20EA08是对铜高敏感且积累较低的品种，体现了同种作物不同品种间耐受铜胁迫的基因型差异。

4 结论

1)铜胁迫抑制油菜幼苗生长，造成叶片黄化萎蔫，显著降低地上部生物量。

2)22个油菜品种对铜胁迫的响应不同，其地上部生物量、铜含量、铜累积量因基因型的不同而存在显著差异。以地上部数据作为筛选指标，得到铜胁迫下地上部生物量较大且铜累积较高的品种H和A10，其名称分别是双油10号和20EA10；得到地上部生物量受铜胁迫影响较大但铜累积较低的品种A09和I，其名称分别是20EA09和沣油737。

3)60 mg/L铜胁迫加速了铜从植物根系向地上部的转移。