HPV E6/E7 mRNA、Ki-67在宫颈上皮内瘤变中的表达

蒋笑霞，李红梅，俞旭云，王福智

（宁海县妇幼保健院，浙江 宁海 315600）

宫颈癌一般由宫颈上皮内瘤变（CIN）发展而来，人乳头状瘤病毒（HPV）是与宫颈病变密切相关的球形DNA病毒[1]，其中E6、E7为高危型HPV早期转录因子。研究发现，持续性高危型HPV感染可致E6、E7蛋白大量表达，增加宫颈组织高级别病变风险，HPV E6/E7 mRNA多作为反映HPV致癌基因活跃状态的指标[2]。细胞增殖相关核蛋白（Ki-67）与肿瘤细胞增殖相关，研究表明，Ki-67表达与CIN呈正相关[3]。本研究探讨了HPV E6/E7 mRNA与Ki-67在不同级别CIN中的表达，并分析其临床意义，旨在为临床提供更多参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2019年3月-2020年3月本院收治的89例子宫颈病变患者。纳入标准：（1）18-65岁；（2）有性生活史；（3）接受病理组织学检查、HPV E6/E7 mRNA及Ki-67检测；（4）临床资料完整。排除标准：（1）既往CIN史、阴道及宫颈治疗史、放化疗史、HPV感染史；（2）处于妊娠期或哺乳期；（3）合并宫颈外的其他恶性肿瘤；（4）合并肝肾等功能不全、免疫系统疾病、凝血功能障碍；（5）既往接受免疫抑制剂治疗。根据组织病理学检查结果，根据宫颈上皮内瘤变的级别进行分组[4]，其中CIN1级组18例、CIN2级组31例、CIN3级组26例和宫颈鳞状细胞癌组14例。选取同期本院收治的23例子宫良性病变患者为对照组，术中取正常子宫颈组织作为对照。各组年龄、孕次、产次比较差异均无统计学意义（P＞0.05），详见表1。研究经本院伦理会批准，且患者知情同意。

表1 各组一般资料比较

1.2 方法

1.2.1 标本收集 （1）宫颈细胞：检测前3天无性生活、无阴道冲洗或用药，经期内患者择期检查；利用一次性窥阴器充分暴露患者宫颈，清理宫颈口分泌物后，宫颈细胞刷顺时针轻旋转收集脱落细胞；置于宫颈细胞保存液（美国Hologic公司）4℃保存。（2）宫颈组织：手术收集宫颈组织，以10%中性福尔马林固定、石蜡包埋；连续切片，层厚4μm，48℃展片。

1.2.2 HPV E6/E7 mRNA检测 取宫颈细胞，采用荧光PCR染料法行HPV-DNA检测，操作按照HPV-DNA检测试剂盒（博奥生物集团有限公司，货号340020）说明书，荧光PCR仪（美国ABI公司，型号7500）定量分析，以≥500拷贝数为阳性，反之为阴性。采用转录介导的等温扩增法（TMA）进行HPV E6/E7 mRNA检测，操作按照HPV E6/E7 mRNA试剂盒（美国Hologic公司，货号 10210）说明书，根据分析物信号与阈值之比（S/CO）进行判读，S/CO≥1.0为阳性，反之为阴性。

1.2.3 Ki-67检测 取宫颈组织切片，采用免疫组化SP染色法检测；常规脱蜡，置于3%过氧化氢溶液处理5分钟；蒸馏水冲洗3次，浸入0.1mol/L柠檬酸钠缓冲液中，高压加热至喷汽3分钟，冷却后用PBS溶液（福州迈新生物技术开发有限公司，货号PBS-0061）冲洗1-2次；滴加Ki-67单克隆抗体（福州迈新生物技术开发有限公司，货号：MAB-0672），4℃过夜；PBS溶液冲洗2分钟，滴加HRP标记鼠/兔二抗（福州迈新生物技术开发有限公司，货号：Kit-5030）30℃ 15分钟；PBS溶液冲洗 1次/min，连续3次；按照DAB显色试剂盒（福州迈新生物技术开发有限公司，货号：DAB-1031）说明书操作，苏木素复染1分钟后依次行脱水、透明和封片处理，显微镜下观察染色情况；以细胞核内出现棕黄色或棕褐色颗粒为阳性，反之为阴性。

1.3 观察指标 比较各组HPV E6/E7 mRNA和Ki-67的表达情况，并分析HPV E6/E7 mRNA和Ki-67阳性表达率与宫颈上皮内瘤变级别的相关性。

1.4 统计学处理 采用SPSS20.0软件对数据进行统计分析。计量资料用（±s）表示，两组比较采用独立样本t检验，三组比较采用单因素方差分析，两两比较采用Snk-q检验。计数资料用百分率表示，采用χ2检验。HPV E6/E7 mRNA和Ki-67阳性表达率与宫颈病变程度相关性采用Spearman秩相关分析。

2 结果

与对照组比较，CIN1级组、CIN2级组、CIN3级组及宫颈鳞状细胞癌组HPV E6/E7 mRNA、Ki-67阳性表达率升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）。HPV E6/E7 mRNA及Ki-67阳性表达率与宫颈病变程度呈正相关（rHPVE6/E7mRNA=0.712，P＜0.01；rKi-67=0.698，P＜0.01）。 详见表 2。

表2 各组HPV E6/E7 mRNA、Ki-67的表达[n（%）]

3 讨论

宫颈鳞状细胞癌为宫颈癌常见病理类型，其发生发展是一个渐进过程，多由宫颈不典型增生发展而成[5]。HPV持续感染已被证实与宫颈病变密切相关，且为宫颈鳞状细胞癌发生的独立危险因素[6]。HPV基因组包括早期基因区、晚期基因区和长调控区，E6和E7是位于HPV早期基因区的致癌基因，其编码的蛋白可致宫颈上皮癌变，并在病变进一步发展过程中参与病毒DNA复制、转录，促进宫颈癌变[7]。Ki-67是与肿瘤细胞增殖相关抗原，其阳性率越高提示肿瘤细胞有丝分裂数高，生长较快，组织分化能力就差。Min等[8]研究发现，宫颈癌和CIN2-3级患者宫颈组织Ki-67表达水平高于CIN1级，宫颈癌Ki-67表达水平高于CIN2-3级，Ki-67表达水平与HPV感染呈正相关，提示检测Ki-67对于CIN和早期宫颈癌诊断具有一定临床价值。

本研究采用支链DNA信号扩增法检测宫颈组织HPV E6/E7 mRNA表达，发现宫颈病变组织HPV E6/E7 mRNA阳性表达率增加，符合以往研究结果[9]，相关性分析提示，HPV E6/E7 mRNA表达与宫颈病变程度呈正相关，提示HPV E6/E7基因过度表达可能与CIN和宫颈癌变过程有关，分析原因为E6/E7基因编码致癌蛋白与细胞内p53和pRb两种主要抑癌蛋白结合，调控和改变细胞生长周期及DNA修复，使宿主细胞基因组有游离状态逐渐以整合状态存在，最终导致宫颈癌变[10]。本研究采用免疫组化SP染色法检测不同宫颈病变组织Ki-67，发现子宫颈病变组织Ki-67阳性表达率增加，与以往研究结果一致[11]，相关性分析显示，Ki-67表达与宫颈病变程度呈正相关，机制可能与癌细胞上皮间充质转化及细胞自噬有关[12]。

综上，HPV E6/E7 mRNA和Ki-67在子宫颈病变组织中阳性表达率较高，且与病变程度呈正相关，临床可行HPV E6/E7 mRNA和Ki-67检测，以便早期发现宫颈上皮恶性变，进一步提高患者预后。