生物标志物诊断斑块侵蚀的研究进展

伍垚 综述 陈剑玲 审校

遵义医科大学附属医院心血管内科，贵州 遵义 563000

长期以来，冠脉动脉粥样硬化血栓形成造成急性冠脉综合征（acute coronary syndrome，ACS），被人们认为斑块破裂（plaque rupture，PR）是其主要病理机制，但从尸检观察中得知，少数情况下斑块侵蚀（plaque erosion，PE）也可引起闭塞性血栓形成[1-2]。且尸检研究表明PE的病变特征为：纤维帽完整，富含平滑肌细胞和细胞外基质，伴有内皮细胞的凋亡和缺失，巨噬细胞浸润少见，脂质坏死核心极少见，主要形成白色血栓；而PR的病变特征为富含脂质坏死核心和薄纤维帽破裂伴大量巨噬细胞浸润，平滑肌细胞和细胞外基质含量少，主要形成红色血栓[1，3]。从病理学和影像学研究证明25%～40%的ACS患者与PE有关，目前其诊出率出现上升趋势[3-4]。目前，光学相干断层扫描成像（optical coherence tomography，OCT）是体内诊断PE的唯一成像方式，但它是一种侵入检查，一方面存在限制，当冠脉存在大量血栓，尤其是红色血栓时，很难观察到斑块形态，或者存在冠脉血管极度扭曲，或者患者病变位于左主干、冠状动脉搭桥病变、远端部位，容易导致成像不清晰[5]。另一方面，虽然OCT相对安全，但其存在很多潜在的严重并发症风险，如冠状动脉夹层、穿孔或急性闭塞[6]。以上原因使PE不能被准确识别，医生们考虑能不能寻找一种易于识别PE的诊断形式？所以有研究考虑从PE发病机制出发，在不增加侵入性操作的情况下，通过测定与PE相关的生物标准物来诊断PE，以便能够指导ACS患者进行个性化治疗。

1 斑块侵蚀的病理机制

PE的主要潜在病理机制包括平滑肌细胞和细胞外基质增多、血管内皮细胞缺乏和血小板活化[7-8]。由于PE中平滑肌细胞的过度增殖迁移，分泌大量的透明质酸和多功能蛋白聚糖等细胞外基质。透明质酸作为细胞外基质成分，正常生理情况下，发挥抗炎和抑制氧化损伤的作用。当机体发生感染和组织损伤时，透明质酸通过透明质酸酶-2（hyaluronidase 2，HYAL2）将高分子量的透明质酸片段降解为促炎性的低分子量的透明质酸片段，通过CD44受体结合，参与局部炎症，诱导内皮细胞的剥脱、凋亡及中性粒细胞的募集和激活；透明质酸可与纤维蛋白、纤维蛋白原和纤维粘连蛋白等相互作用，构建临时微环境，诱导血栓形成[9-10]。有研究表明miR-3667-3p可能参与了细胞外基质的沉积，并观察到循环miR-3667-3p水平与纤维化斑块成分（主要由胶原、蛋白多糖和平滑肌细胞组成）呈正相关，参与了PE的发生[11]。最近一项使用计算流体力学和OCT的人体研究证明血流紊乱是内皮细胞死亡的潜在因素[12]，动脉粥样硬化小鼠在体实验表明血管内皮细胞中先天免疫受体Toll样受体2（toll-like receptor 2，TLR2）在血流紊乱部位的局部过度表达[13]。透明质酸可激活TLR2，引起内皮细胞剥脱，并可能导致其凋亡，以致于形成血栓；TLR2激活同样能募集大量中性粒细胞。中性粒细胞激活后形成中性粒细胞胞外诱捕网（neutrophil extracellular traps，NETs），其由髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）、瓜氨酸组蛋白和dsDNA组成。NETs可进一步增强内皮细胞应激和剥脱以及凋亡，损伤的内皮可激活血小板和凝血系统；也能网罗大量血小板与纤维蛋白原，还直接与凝血酶与血小板相互作用，从而形成血栓[14-15]。中性粒细胞分泌的基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）可能通过降解基底膜上非纤维性Ⅳ型胶原致使内皮剥脱，引起PE[16-17]。内皮细胞剥脱造成内膜完整性破坏，引起胶原纤维暴露，会触发血小板的聚集、活化和黏附，形成局部富含血小板的白色血栓[18]。在以上复杂机制的促进下血栓缓慢扩增并逐渐阻塞血管，导致心肌损伤而发生ACS。

2 生物学标志物与斑块侵蚀

2.1 HYAL2透明质酸是形成PE的重要成分之一。KOLODGIE等[19]报道了PE病变斑块/血栓处透明质酸及其受体CD44有较强的免疫染色，但稳定斑块或PR斑块部位几乎没有透明质酸蓄积，提示PE患者存在透明质酸代谢异常。近期一项临床研究从PE病变大量聚集透明质酸这一病理现象入手，结果：HYAL2基因在ACS患者外周血单核细胞中过度表达（M：8.3；IQR：10.2），相比于稳定性心绞痛患者（M：4.9；IQR：4.2）和正常人（M：3.6；IQR：5.0），CD44剪切变体6基因表达在ACS患者中也显著升高；PE与PR患者相比，HYAL2和CD44v6基因的表达显著增高（HYAL2：M：15.2；IQR：17.6vsM：7.3；IQR：4.9，CD44v6；M：17.5；IQR：35.3vsM；11.0；IQR：2.3）[20]。随后1年的随访获得的HYAL2和CD44剪切变体6基因表达的数据显示，与急性期分析相同的PE患者相比，HYAL2和CD44剪切变体6基因的表达显著降低（M；15.2；IQR：17.6vsM；2.0；IQR：0.7），表明了HYAL2和CD44剪切变体6基因的变化仅限于ACS的急性期。HYAL2在ACS中PE发挥了重要作用，HYAL2可能是一个潜在的有用的生物标志物，用于无创鉴定PE。

2.2 miR-3667-3p MicroRNAs（miRNAs）是 一类非编码RNA，参与心血管病理生理过程，如调节动脉粥样硬化、脂质代谢、炎症等细胞外基质的含量[21]。袁玉娟等[22]研究表明ACS患者冠脉血内miRNAs表达具有差异性，提示冠脉血内miRNAs可能与ACS发生急性血栓事件相关。近年来研究表明miRNAs在心血管疾病发生、发展和心肌梗死的预后有关[23-24]。其中一项研究以ACS患者为对象，以PR患者为对照组，期望筛选出PE具有特征性表达的循环miRNAs，从中得出与PR组相比，PE组仅miR-3667-3p显著升高。该研究测定了血浆miR-3667-3p水平的敏感性和特异性，分别为0.696、0.733，调整传统危险因素后，miR-3667-3p水平升高是PE的独立预测因子[11]。所以循环miR-3667-3p可作为鉴别PE和PR的潜在生物标志物。以上研究只是初步筛选出PE患者差异表达的miRNAs，具体通路机制及作用需后续进行相关动物实验和临床试验进行研究，才有望为ACS疾病诊断、治疗及预后等提供新途径。

2.3 MPO中性粒细胞的募集活化与PE病变血栓发生有密切相关。MPO是一种血红素氧化酶，主要表达于中性粒细胞嗜天青颗粒中，是中性粒细胞激活的标志。内皮细胞凋亡和剥脱可能暴露于次氯酸，是MPO产生的一种强有力的氧化剂，可促进培养的人内皮细胞凋亡，引起组织因子基因表达的剧增；因此MPO作用可能刺激PE的内皮细胞凋亡。这种酶在PE患者血液中和局部病变部位高度表达，相反PR很少显示这种关联[20，25]。FERRANTE等[26]发现确定发生PE的患者血浆中的MPO水平明显增高。另外将因冠心病猝死患者的病变血管标本进行免疫组化染色后发现，PE血栓中MPO阳性的细胞的聚集明显大于位于PR中的血栓。另外一项研究也发现，PE的患者MPO水平明显高于PR和无血栓狭窄的患者，其检测值分别为685.9 ng/mL[556.7～962.3]vs340.0 ng/mL[108.0～604.2]vs272.5 ng/mL[115.7～408.3]，以上分析可知PE最佳临界值为MPO≥589 ng/mL[27]。但是有研究发现PR与PE之间MPO的水平无任何差异[28-29]。还需大规模的基础和临床研究数据进一步证实MPO诊断PE的临床价值。

2.4 瓜氨酸组蛋白与dsDNA NETs可促进血栓生成。中性粒细胞激活时肽基精氨酸脱亚胺酶4进入细胞核对组蛋白H3和H4上的特定精氨酸残基进行超瓜氨酸化作用，形成瓜氨酸组蛋白H3、瓜氨酸组蛋白H4，导致染色质解聚，形成NETs。释放到细胞外的瓜氨酸组蛋白可激活血小板，加速血栓形成，同样可诱导内皮细胞产生组织因子，启动凝血过程[30-31]。FRANCK等[32]从人类颈动脉内膜切除的PE病变斑块进行瓜氨酸组蛋白H4的定位显示在PE病变处表达。有研究报道瓜氨酸组蛋白与dsDNA可一起作为NETs形成的替代标记物[33-34]。一项研究通过测量ACS患者的dsDNA浓度来评估NETs的循环水平，证实了ACS患者初发时循环中的dsDNA浓度显著高于健康患者，并测定了急性冠脉综合征患者的最佳临界值的dsDNA浓度为400.69 pg/μL（灵敏度89.2%，特异度96.0%），可作为早期诊断的一种新的循环标志物；还证明了dsDNA浓度高的患者，发生主要不良心血管事件的风险高[35]。很遗憾的是，这项研究并没有将ACS分为PR组与PE组进行对比，不能明确dsDNA与PE明确相关性。利用PE患者斑块处存在NETs为特征，将瓜氨酸组蛋白与dsDNA作为NETs的分子标志物，具有潜在的临床应用价值，为PE的非侵入性辅助诊断提供了可能。

2.5 血小板反应蛋白（Thrombospondins，TSP）TSP是一种基质细胞糖蛋白，家族中有TSP-1、-2、-3、-4和-5五个成员。TSP-1和TSP-2是三聚体基质细胞蛋白，其组结构及功能均高度一致，二者通常是由被激活的血小板和内皮细胞所分泌，参与调节动脉血管壁的结构和功能[36]。有研究示，在冠状动脉和外周血清样本中，进行细胞因子及酶联免疫吸附测定分析，TSP-1在PE患者中的表达明显高于PR患者[28]。TSP-1在PE的具体机制尚不清楚。从既往研究得知TSP-1通过与其受体CD47结合，在早期似乎通过诱导内皮功能障碍，刺激平滑肌细胞增殖和抑制胶原沉积而促进动脉粥样硬化的形成。也同样发现与斑块纤维帽相关的血管平滑肌细胞、炎性细胞和泡沫细胞中能检测到TSP1表达[37-38]。是否TSP-1与PE的内皮细胞凋亡及厚纤维帽有关，仍需进行大量的研究。TSP-2通过刺激巨噬细胞的吞噬功能发挥抗动脉粥样硬 化 作 用[36]。TOPOL等[39]发 现TSP-2单 核 苷 酸多 态性对冠心病具有保护作用。在一组因PE导致的心脏猝死患者中，检测编码TSP-2的基因多态性仅在PE中降低，提示与斑块侵蚀有关[40]。但在血清或血小板中不存在TSP-2基因产物[41]，故不能将其作为生物标志物。未来需进一步研究TSP-1、TSP-2对PE的调节机制，揭示这些调节模式并认识其功能意义将是非常有意义的。

2.6 MMP MMP-2和MMP-9可能是参与动脉粥样硬化的主要基质金属蛋白酶，在PE中呈现降解斑块基底膜Ⅳ型胶原纤维的主要作用。其中一项体外实验将不同TLR2激动剂（如脂多糖、Pam3、透明质酸）对内皮细胞和中性粒细胞共同培养，培养结束后通过内皮细胞上清液的明胶酶谱分析显示MMP-2、MMP-9活性提高；在加入中性粒细胞之前用阻断TLR2的抗体预处理内皮细胞，很大程度上阻止了共培养上清液中MMP-9活性的增加[15]。该研究表明TLR2激动剂增强其MMP-2和MMP-9的活性。临床实验研究表明，MMP-2在急性冠脉综合征中水平显著升高，明显高于稳定性心绞痛组和健康对照组[42]。但有临床研究显示PR患者的血清MMP-9水平高于PE患者[27-28]。以上研究结果的差异可能与体外与体内研究的微环境存在不同有关，或MMP-2、MMP-9分别独自反映PE的血标志物具有一定的局限性。

3 总结

本综述先简要概括了PE的潜在病理机制，然后总结了近年来发表的主要研究结果，确定了与PE有关的生物标志物。HYAL2、miR-3667-3p、MPO具有较高的预测价值，dsDNA、瓜氨酸组蛋白、TSP、MMP在PE患者具有不同表现不能明确其与PE间的关系，仍缺乏大量的动物及临床研究。PE作为引起ACS的第二大病因，如果能通过上述指标明确诊断，将可能针对这部分患者进行个体化、精准化的治疗，从而对ACS的诊疗产生深远的影响。