TGF-β1/Smad信号通路与糖尿病肾病关系的研究进展

赵婷 综述 张祥贵 审校

遵义医科大学第五附属(珠海)医院肾内科，广东 珠海 519000

据流行病学调查结果显示2019 年全球糖尿病患病人数总计4.63 亿，预计到2030 年将上升到5.78 亿，到2045年将高达7亿[1]。目前预测中国为全球糖尿病患病人数最多的国家，使DKD逐步成为慢性肾脏病第一大病因。由于DKD 发病率随着糖尿病患病时间的增长而增加，采用控制血糖、控制血压、控制血脂等方式治疗后，可延缓疾病的进展，却难以阻止疾病的进展。从DKD 发病机制入手进行研究具有广阔的发展前景。DKD 发病涉及多种细胞因子及其所参与的信号通路调控，导致以弥漫性肾小球基底膜增厚、足细胞数量减少、肾小球系膜扩张等为基础的病理改变。TGF-β1在DKD 中表达上调，为参与疾病发生发展的主要细胞因子之一。许多学者认为在DKD 的病情进展中，TGF-β几乎与所有的分子介质改变及细胞内信号通路调控有关[2]。其中，TGF-β1通过 Smads 蛋白激活介导的信号传导已被广为研究，作为经典信号途径参与信号传递及核基因转录。本文着重于了解TGF-β1/Smad信号通路在DKD的发病机理中的作用。

1 TGF-β1/Smad信号通路组成

TGF-β是TGF-β家族的主要成员之一，由三种结构亚型组成(TGF-β1、2、3)；其中TGF-β1是体内含量最丰富的亚型，可被各种类型的肾脏细胞及侵润的炎性细胞分泌，发挥调节增殖、迁移、分化和凋亡等作用。在DKD 中的TGF-β1基因表达上调合成分泌增多，分泌的TGF-β1先后与潜伏期相关肽结合成为小休眠复合体，与潜在的TGF-β结合蛋白结合形成大休眠复合体，以无活性形式储存于细胞外基质中。无活性的TGF-β1与纤溶酶、ROS、血小板反应蛋白1和酸等相互作用下释放出具有活性的TGF-β1。TGF-β1与细胞表面上的受体结合促使信号传导入细胞内。TGF 家族受体由两个“Ⅱ型”和两个“Ⅰ型”跨膜丝氨酸/苏氨酸激酶受体组成，目前被鉴定出5个Ⅱ型受体(BMPRⅡ、ActRⅡ、ActRⅡB、TβR2、AMHR)和 7 个Ⅰ型受体(ALK-1、2、3、4、5、6、7)[3]。尽管相同组合的受体可结合不同的配体，但配体与受体组成的复合物才能决定诱导信号通路的特异性。当TGF-β1与TβR2结合时就会激活 TGF-β1/Smad 信号传导，TβR2 激活并磷酸化TβR1(ALK5)，激活的TβR1 在C 端丝氨酸处使Smads磷酸化，进而将信号传入细胞内发挥生物学活性。当TGF-β1与TβR2、ALK1结合则激活Smad1和Smad5的信号通路。

Smad 家族作为信号通路的下游成分主要被分为3 大类，分别为受体调节的Smads (R-Smads)、共调节的Smads(Co-Smad)、抑制性Smads(Ⅰ-Smads)[4]。R-Smads 包括Smad1、Smad3、Smad5和Smad8。Smad1、5、8 则由 BMP 家族细胞因子刺激激活。TGF-β1与TβR2、TβR1受体结合后磷酸化激活Smad2、3，激活的Smad2、3 与Smad4 形成异三聚体复合体，进而转运到细胞核结合调控靶基因的转录。Smad2、3、4结构上包含一个保守的MH1 结构域、C 端的MH2 结构域及其中间的连接结构，负责与特定序列的转录因子相互作用。其中，Smad3、4 的 MH1 结构域可以结合 DNA 调节目标基因转录，但Smad2 缺乏该功能。Smad7 的表达高度受细胞外信号的调节，在通路激活后表达增加，阻止R-Smad进入TβRⅠ、并促进Smads及TβR1、2泛素化降解以拮抗TGF-β1/Smad 信号通路，起到负反馈调节作用[5]。蛋白酶体如Smad 泛素化调节因子2(Smurf2)可结合C 端磷酸化的Smad2、3，使其去磷酸化，进而调节R-Smad 转运进入细胞核的水平[6]；而Smad4 不受泛素介导的降解。协同阻遏物SnoN，Ski 和 TGIF 通过抑制 R-Smads 来防止基因转录[7]。这些拮抗剂对于确保调节TGF-β1/Smad 的基因转录至关重要。

2 TGF-β1/Smad信号通路在DKD激活与失衡

2.1 转化生长因子β1长期研究中已经证实TGF-β1在各种与纤维化有关的肾脏疾病中高表达，肾脏也容易受到TGF-β1过度表达的影响。在DKD 中，高血糖会导致TGF-β1基因、TGF-β1蛋白及其受体的表达增加。过量表达的TGF-β1可激活下游Smad信号通路激活，刺激ECM 产生沉积，诱导肾小球和肾小管上皮细胞向间充质转化(EMT)[8]。TGF-β1诱导ECM沉积主要是通过刺激基质蛋白的产生增多，抑制促使ECM 水解的蛋白酶的活性，最终形成胶原蛋白、纤连蛋白、层黏连蛋白和内皮素在肾小球系膜和上皮细胞沉积[9]。在DKD 的早期和晚期肾固有细胞TGF-β1表达增加，与糖尿病患者的血糖控制呈负相关。同样的，HATHAWAY 等[10]研究中指出尿液葡萄糖输出量随着TGF-β1表达增加而增加，证明了TGF-β1与DKD病情变化具有相关性。升高的血糖水平增加了糖基化终末产物(AGEs)及氧化应激产生，通过多元醇途径，蛋白激酶C途径及己糖胺途径参与病理过程。研究中证明用中和TGF-β抗体或抗寡核苷酸干预可以减轻肾纤维化[11]。过度表达活性形式TGF-β1促进肾脏病进展，而过度表达潜在TGF-β1却获得与此相反的结果。HUANG等[12]发现正常小鼠中血浆潜在TGF-β1增加10倍仍具有正常的肾脏组织学和功能，而转基因技术增加梗阻性肾病潜在TGF-β1表达则可以改善肾纤维化。近期发现TGF-β1不仅在肾脏组织、血清中增多，而且在患者尿液中含量增加，与肾功能下降具有相关性[13]。在疾病条件下，可通过TGF-β1/Smad 信号通路介导肾纤维化，也可以通过许多应激分子(例如血管紧张素Ⅰ、Ⅱ)和 AGEs 与 ERK/p38/MAPK-Smad 串扰途径参与疾病进展[14]。TGF-β1激活Smads 发挥致纤维化作用，显示出Smad 信号通路在糖尿病肾脏内失调，如：1 型糖尿病肾病的实验动物模型中Smad3、TGF-β1表达升高，同时在体外实验中，高糖培养诱导系膜细胞、肾小管上皮细胞等细胞Smad2和Smad3蛋白的表达上调[15]。在DKD 中Smad7 表达较正常肾脏表达减低，并且与肾脏病理改变呈负相关性，Smad7表达减低的同时伴随R-Smad升高[16]；予以Smad7基因敲除的DN 小鼠表现出更严重的肾损伤[17]，表明Smad7表达失衡参与DKD 疾病进展。Smad4 作为信号传导通路中的重要组成部分同样报道在糖尿病的人和小鼠中表达上调[18]，验证了TGF-β1/Smad 通路表达失衡在疾病中起到重要的作用。

2.2 R-SMAD R-Smad 中的 Smad2、3 作为信号通路的关键组成成分调节通路平衡。在糖尿病鼠和人类DKD 中TGF-β1/Smad 通路失衡主要表现为Smad2 和 Smad3 异常激活。而同样作为 TGF-β1的下游信号，Smad2、3 可能存在不同的作用性质。两者结构上的差异可为解释两者作用性质差异作出贡献。首先，Smad3 的MH1 结构域可以结合DNA 调节目标基因转录，被认为具有致肾纤维化作用，而Smad2 的MH1 结构域则不具有该功能[3]。小鼠Smad3 的基因缺失阻止糖尿病肾病鼠模型中的病理进展，这一发现证实了Smad3 的致纤维化作用[19]。Smad3 激活后可增加与促进纤维化基因的结合，上调蛋白质表达，如：COL1A1、COL3 A 1、COL5A2、COL6A1、COL6A3、COL7A1[20]。Smad3特异性抑制剂减缓近端肾小管上皮细胞的转分化并减轻肾纤维化也反面证实了Smad3促纤维化作用[21]。与Smad3 不同的是，Smad2 由于其基因敲除的小鼠胚胎致死性，导致其在慢性肾脏病中作用效果未完全了解。Smad2的过度表达降低了肾小管上皮细胞中TGF-β1诱导的Smad3磷酸化，起肾脏保护作用[22]。近期另外一个研究得出不一样的结论，利用杂交获得条件性Smad2敲除小鼠模型，使肾小管细胞及内皮细胞Smad2 表达降低，结果致TGF-β1 及Smad3 蛋白低表达，减缓ECM 积累并改善了CKD 病理，提示Smad2 具有促纤维化作用[23]。这个实验结论与既往研究结果存在较大的差异，可能与不同动物模型相关，应进一步论证。

2.3 Co-Smad TGF-β1/Smad 信号通路中共调节蛋白主要包括Smad4，其与p-Smad2、3 结合形成复合物后将信号转入细胞核，调节基因转录。既往研究中由于Smad4 KO小鼠的致死性，导致其在TGF-β1介导的纤维化和炎症反应中的作用不清楚。近来研究发现Samd4升高激活Smad信号传导促使高糖培养的系膜细胞表达更多的纤连蛋白[24]，论证了Smad4 表达失调在DN具有致病作用。Smad4在肾脏炎症及纤维化方面具有不同的表现。肾脏中Smad4 的缺失表现出致炎性，可能通过增加白细胞浸润、炎症因子分泌及抑制Smad7 的转录等发挥作用[25]，白细胞浸润来源的巨噬细胞被证实具有进一步分化为产生胶原蛋白的成纤维细胞的能力[26]。与之不同的是在DKD 中发现Smad4 表达上调，有条件的使Smad4 缺失可以抑制进行性肾纤维化。例如，使用抗Smad4 核酸的去耗竭Smad4 阻止了DKD 小鼠的进行性足细胞损伤和肾小球硬化[18]。有趣的是，Smad4 缺失抑制肾纤维化的机制可能与抑制Smad2、3激活无关，因为Smad4的破坏不会改变Smad2、3的磷酸化水平，也不会使磷酸化的Smad2、3 发生核易位。但是，Smad4 的缺失会影响Smad3介导的启动子活性以及Smad3与COL1A2启动子的结合，进而影响与胶原启动子的结合活性，从而抑制纤维化反应[25]。

2.4 Ⅰ-Smads TGF-β1/Smad 信号通路中抑制性Smads 主要包括Smad7，负反馈调节该信号通路。糖尿病肾病小鼠在注射STZ 的16 周后出现Smad7 mRNA 表达明显下降，伴随TGF-β1升高，肾纤维化明显加重[27]。Smad7异常降低使TGF-β1/Smad信号通路激活增加，结合与上皮-间质转分化(EMT)相关基因的基因启动子，调节EMT相关基因的表达[28]。Smad7通过以下两方面调节信号通路：一方面Smad7 通过与TβRI的相互作用抑制TGF-β家族与受体结合，并与R-Smads竞争受体激活；另一方面Smad7通过与Smad泛素调节因子(Smurfs)和其他E3泛素连接酶相互作用诱导受体降解，下调TGF-β1/Smad 信号通路。Smad7降解增加伴随着Smad2、3 的激活和肾纤维化进展。Smad7的过度表达不仅抑制TGF-β1/Smad信号通路中R-Smad 异常激活，还可以减少EMT 的发生[29]。将Smad7 基因转移至糖尿病小鼠模型的肾脏，使Smad7过表达可抑制Smad2、3磷酸化，改善肾组织学病理表现[30]。SIERRA-MONDRAGON[31]证实了药物可以通过增加肾小球和肾小管Smad7 的表达，可以下调Smad3的表达，降低蛋白尿，减少早期损伤标志物和中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白表达。因此，诱导smad7 表达降低可能是驱动的肾脏炎症的机制，增加smad7表达有望成为治疗DKD的靶点。

2.5 糖尿病肾病中氧化应激及糖代谢异常对通路的影响 糖尿病患者存在不同程度糖耐量受损，使脂肪酸成为更多的能量源，导致氧化磷酸化增多。超氧化物随着线粒体电子传递链增加而增加，包括活性氧(ROS)、H2O2等[32]。肾脏组织中表达了多种Nox同工酶，包括Nox1、Nox2、Nox4 和 Nox5(在人类基因组的情况下)及其辅助蛋白，这些同工酶是正常肾脏和病理状态下ROS的主要来源之一。其中，NOX4(NADPH氧化酶4)在TGF-β1刺激下由Smads蛋白介导而产生增加，使细胞内ROS增多，促进ECM及抑制其降解[33]。进一步研究发现，ROS的生成增多可能与促进潜在TGF-β转化为活性形式、增加Tβ-RⅠ(ALK5)的磷酸化，促进TGF-β/Smad 信号传导等相关。同时，TGF-β1通过刺激p53磷酸化和乙酰化来调节p53活性，促进与活化的Smad的相互作用以及随后p53/Smad3与HK-2人肾小管上皮细胞形成细胞中纤溶酶原激活物抑制剂1(PAI-1)启动子的结合，抑制细胞外基质的降解[34]。TGF-β1诱导的p53 磷酸化和几个促纤维化基因表达的上调取决于活性氧(ROS)的快速生成。抑制呼吸链来源的ROS 产生可以通过降低PAI-1 而降低TGF-β1表达，同样验证了ROS参与TGF-β1/Smad信号通路调节及其复杂性[35]。糖基化终末产物(advanced glycation end products，AGEs)是蛋白质及多肽物质经非酶糖基化修饰后改变了正常结构、功能所形成及积累的产物。在糖尿病鼠模型中，AGEs随病情进展积累增多，存在于不同的肾细胞中，如：近端小管细胞、血管内皮细胞和足细胞。其具有不可逆性、难以降解等特点，可通过直接或者间接途径参与肾脏毒性损害，与TGF-β1相关信号通路具有一定相关性。AGEs促进各种炎症介质的激活和表达，如IL-6、TGF-β1、MCP-1 等。AGEs可能通过激活PKC和/或氧化应激导致TGF-β1转录上调[36]。近期研究认为近端小管细胞被认为是AGEs重吸收的主要部位。实验中表现出近端小管细胞TGF-βmRNA 表达上调，AGEs 抑制剂可有效降低肾小管上皮细胞 TGF-βmRNA 表达[37]。尽管 AGEs 的积累与TGF-β1信号通路相互作用与糖尿病性肾病的发病机制有关，但尚不清楚RAS 和两者之间的关系。FUKAMI 等[38]进一步验证了肾小球系膜细胞中Ang Ⅱ、TGF-β1表达随AGEs增加而增多，呈现出时间和剂量依赖性，进一步利用AngⅡ拮抗剂(坎地沙坦)及抗TGF-β中和抗体治疗可阻止Smad2 磷酸化及减少TGF-β1表达。以上研究表明AGEs 与其他蛋白相互作用介导TGF-β1信号通路。AGEs 还可以串联RAGE-ERK/p38 信号通路调节Smad3 表达，过表达Smad7则可消除这种改变[39]。近期实验结果显示抑制AGEs 水平、下调 TGF-β1表达和Smad 2/3 活化可减少基质蛋白的积累，验证了AGEs 与TGF-β1/Smad 信号通路具有相关性[40]。因此 AGEs 与 TGF-β1/Smad 信号通路相互作用，导致肾小球、系膜基质和肾小管细胞内的细胞外基质蓄积，进而产生严重的结构改变。

3 靶向TGF-β1/Smad 信号通路对DKD 治疗的潜力

从理论上讲，TGF-β1是肾纤维化的关键介质，因此靶向TGF-β1信号传导可能是治疗DKD 的良好策略。目前已经有多种方式靶向TGF-β1治疗，包括TGF-β1抗体、肽、受体抗体等。利用TGF-β1中和性单克隆抗体预防了糖尿病小鼠肾小球肥大，成功把该靶向治疗引入了DKD的治疗策略[41]。不幸的是，在最近一项采用TGF-β1特异性抗体治疗糖尿病肾病患者的测试中，未能延缓肾小球滤过率下降及改善蛋白尿[42]。有几个因素可能会阻碍该方法的临床有效性，包括在晚期疾病中存在多种促纤维化因子、阻断了潜在TGF-β1对肾脏的保护作用。CHANG等[43]的研究中证实了这一点，阻断潜在TGF-β1活化可以有效的延缓肾功能恶化及肾纤维化标志物表达。临床应用靶向TGF-β治疗效果并未达到预期期待水平，于是研究人员将治疗目光转向TGF-β受体(TβRⅡ、TβRⅠ)。PARK等[44]发现使用TβRⅠ小分子抑制剂(EW-719)阻断TGF-β1/Smad2/3和ROS信号传导，从而发挥抗纤维化活性。另一位研究者也证明了靶向TβRI 可以抑制TGF-β1/Smad 信号激活，以剂量依赖的方式降低TGF-β诱导的EMT反应及ECM累积，具有抗纤维化的潜力[45]。针对TβR2mRNA的反义寡核苷酸同样可以减少TGF-β1/Smad信号通路失衡，显示出抗纤维化作用[46]。Smad3 的过度反应和Smad7含量减少直接导致TGF-β1/Smad信号失衡，减少失衡是延缓肾功能进展及肾纤维化关键所在，因此Smad3、Smad7信号可能成为治疗的有效策略。Smad3基因敲除的糖尿病小鼠尿白蛋白排泄和血清肌酐水平未见明显升高，延缓肾功能恶化[19]。SIS3是一种特殊的Smad3 抑制剂，已显示在糖尿病性肾病和阻塞性肾病中的有效性。同样的，靶向Smad3依赖性非编码RNA也提示出有利作用[47]。越来越多的证据表明，通过过度表达Smad7 可改善不同肾脏疾病的炎症和纤维化[48]。靶向Smad7 治疗可促进TβRI 降解并抑制Smad2、3、4活性，减少Smad3、4表达，调节TGF-β1/Smad信号通路失衡，进一步延缓DKD 病情进展。近几年来，中药药理研究中也显示了通过调节TGF-β1/Smad 信号通路减轻足细胞损伤及延缓进行性肾功能恶化的作用，例如，黄芪[15]、红豆杉[49]、紫草[50]等。

4 总结

随着糖尿病人口总数逐渐增多，DKD逐渐发展成为我国慢性肾脏病的主要病因之一，针对发病机制研究治疗策略具有良好的前景。根据既往研究，糖尿病中所涉及的炎症、氧化应激等机制与TGF-β1/Smad信号通路共同参与疾病发病与进展。在既往的研究基础上再进一步研究该信号通路，可能为靶向干预DKD的预防和治疗提供新思路。