高通量测序技术在肺部感染性疾病中的应用

肖宇 综述 肖卫 审校

长江大学附属第一医院呼吸内科，湖北 荆州 434000

肺部感染是临床上的常见疾病，多发病，普遍见于各科室，且位于各类感染的首位，急性呼吸道感染造成的死亡人数为总疾病造成死亡数的第3 位，是严重威胁人类健康的疾病之一。病因中，大部分为病原体感染，也可因理化、免疫及药物等因素引起。

细菌和真菌培养的是鉴定致病微生物的金标准方法。然而，通常需要2～3 d才能获得结果，而且这种方法不适用于鉴定病毒。鉴定病毒通常使用聚合酶链反应或抗原检测，但只能检测有怀疑方向的病毒。此外，病毒分离也是确定致病病原体的可靠方法，但是耗时，并且其敏感性可能不够。虽然进行了这些检测方法，但仍有13%～62%的成人肺炎患者中未发现明显的病原体[1-2]。

高通量测序技术(high-throughput sequencing)一次可以对数十万到数百万的DNA 或RNA 分子进行测序，该技术使得检测速度极大加快。同时相比于第一、二代测序技术，核酸测序的单碱基成本大幅下降，因此又被称为“下一代”测序技术(“next-generation”sequencing technology，NGS)。不同于传统的微生物培养，其通过直接对临床样本中的核酸进行检测，然后再与数据库比对分析，最后依据比对到的序列信息可判断样本包含的病原体种类。通过该技术，可快速、客观地检测送检标本中所包含的病原微生物(细菌、真菌、病毒、寄生虫等)，而且无需费时的进行特异性扩增，对于急危重症和疑难感染的诊断尤其适用[3]。

自2014 年NGS 首次被报道应用于联合免疫缺陷综合征合并感染的一位患者，并在寻找病原体中起到关键性作用[4]，到2016年美国FDA正式的认可NGS技术。近年来已越来越多的应用于肺部感染性疾病病原菌的诊断[5]，并对细菌在疾病发展中作用的理解得到了更近一步加强。

1 在肺部微生物群落检测中的应用

在过去的几十年中，人们一直认为隆凸以下的肺部是无菌的，但近年来NGS 的不断应用，已证实肺部并不是无菌的，有大量厌氧菌和好氧菌定植。HILTY等[6]使用基因测序技术对下呼吸道中存在的重要微生物群进行了报告，比较了哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)受试者和健康对照组中三种不同人类栖息地的微生物群。他们比较了通过表面拭子取样的鼻腔和口咽微生物群，以及通过支气管刷取左肺上叶黏膜表面取样的下呼吸道微生物群。在8名对照受试者的气道刷检中，鉴定出了几个不同的细菌门。此外，在健康对照组、哮喘组和慢性阻塞性肺疾病组的受试者中，微生物群落的丰度相似，但细菌群落组成有显著差异。

对正常成人肺部标本进行16S rRNA测序鉴定提示，肺部的常见细菌种群为变形杆菌、厚壁菌门和拟杆菌门，而在属的水平上，链球菌、普雷沃氏菌和韦氏菌占优势，嗜血杆菌和奈瑟氏菌较小[7-8]。然而，与上呼吸道的菌群数量相比，它相对稀疏。据报道，支气管的群落组成与上呼吸道相似，但生物量较少。该结果表明肺微生物组的来源可能是从上呼吸道吸入的[9]。

而且肺部支气管黏膜上的细菌定植并也不是单一的菌群，不同的呼吸系统疾病状态下的呼吸道菌群组成也并不相同，肺部感染并不是病原微生物对无菌空间的侵袭，而是微生物丰度的发生了变化。对于传统技术检测，如果在呼吸道标本中发现有口咽部常见细菌，那么将不能除外为口咽部污染所致。而对于NGS检测可通过其相对丰度的变化进行进一步的判别。

通过对确诊为支气管扩张患者的测序分析显示，该类患者的肺部细菌群落主要为假单胞菌属、嗜血杆菌属和链球菌属，且假单胞菌和嗜血杆菌占优势的微生物群已被证明与严重疾病和频繁恶化有关[10]。该结果支持了培养报告中的发现优势微生物，但同时表现出个体内稳定性和较大的个体间变异性。

在稳定的慢性阻塞性肺病中，其中微生物密度从上呼吸道到下呼吸道呈梯度下降，其中来自上气道的吸入被认为是主要来源[11]。GALIANA等[12]发现，与轻度或中度气流阻塞的患者相比，严重气流阻塞的患者在痰样本中表现出较低的菌群多样性和较高的细菌载量。这一发现已经在痰和支气管肺泡灌洗取样中重现[13]。这些研究还报道了肺功能下降的微生物菌群向潜在致病细菌属的转变，特别是属于如假单胞菌属或嗜血杆菌属的细菌。

迄今为止，通过NGS 检测，人们已认识到健康人群肺部并非无菌，且证明了健康人群和肺疾病人群之间肺部微生物群落的差异，并也了解到了肺内微生物菌群失调与肺部疾病之间的关联。

2 在重症感染患者的应用

NGS 有能无偏性的病原体覆盖检测，灵敏度高；并且可以明确病原体的种类和分型，还可提供耐药基因和毒力因子的分析。在临床实际应用中，对患者的抗菌药物选择和治疗效果评价具有一定的指导意义，是明确感染性疾病病原菌的有效手段[14]，尤其适用于急危重症和疑难感染的诊断。有研究表明对重症感染病人的血标本进行高通量测序检测与细菌培养进行比较，整体诊断敏感性由单纯细菌培养的12.82%显著提高至单纯 NGS 的 30.77%[15]。XIE 等[16]对上海交通大学医学院附属上海总医院重症医学科的178例重症肺炎患者进行回顾性分析提示，在重症肺部感染患者中应用NGS 能够早期明确致病菌，并指导抗菌药物选择和治疗，最终降低死亡率。相较于常规微生物学检测，NGS在检测致病菌方面显示出显著更高的阳性率(68.7%vs 45.4%)。

2018年的一项回顾性研究也表明，相较于传统培养，NGS具有更高的敏感性。同时在对结核、真菌、病毒和厌氧菌感染的诊断方面有更大的优势[17]。而且在抗菌药物使用的影响方面NGS也小于传统培养方法，并且可以依据检测报告来进行抗菌药物治疗方案的调整。

3 在特殊类型感染患者中的应用

对于免疫缺陷患者、传统检测结果阴性且治疗效果不佳的感染患者和反复多次住院治疗的患者，其感染灶的致病微生物复杂，通常不同于正常人群的致病菌。其致病菌可能为机会性致病菌或携带多重抗生素耐药基因的病原体[18]。对比于传统检测方法，NGS是更好的辅助检测手段[19-20]。

PAN等[21]在一项对免疫功能低下合并社区获得性肺部感染的研究中显示，在病毒和真菌方面的检测上NGS有着明显优势，而且对于混合感染方面也优于传统检测手段。2019年有报道在1例血功能衰竭反复因肺部感染住院治疗患者中利用NGS检测肺泡灌洗液，证实为肺孢子虫感染[22]。GU 等[23]报道了5 例抗感染治疗效果不佳，经过对支气管肺泡灌洗液和肺组织进行NGS 检测，最终确诊为鹦鹉热衣原体，并针对性调整抗菌药物治疗后病情好转。LANGELIER 等[24]对由于呼吸道感染入院的骨髓移植患者，运用NGS检测患者的肺泡灌洗液样本，结果证实呼吸道感染的骨髓移植患者肺部存在HRV-A、HHV-6、CMV、HSV、EBV、人乳头瘤病毒及扭矩特诺病毒等多种病毒，以及存在少见的致病性细菌如轻型链球菌及棒状杆菌。有研究表示，在免疫缺陷合并感染患者的致病菌诊断方面，NGS检测有着重要的作用[25]。并且对于该类患者NGS在细菌和病毒感染的诊断方面，阳性率是传统检测方法的3 倍以上。

对于结核感染，华山医院的周晛等[26]排除活动性结核感染患者，NGS 均未检出结核序列，特异度为100%。但对9 例确诊活动性结核患者和10 例临床诊断为活动性结核病患者进行NGS 检测，敏感度为57.9%。对同一患者的标本同时送检Xpert MTB/RIF与NGS，提示NGS 和Xpert MTB/RIF 两者的敏感度、特异度并无统计学差异。

4 结果判读

常见的结果指标有检出序列数、深度、离散度、基因组覆盖度和微生物丰度。在结果中某病原体的检出序列数、深度、离散度和基因组覆盖度越高，表示检测到该微生物的可靠性越高[3]。SIMNER等[27]认为，对于检测细菌、真菌和寄生虫的阳性判断，为每百万映射读取的序列数≥阴性对照的10 倍；病毒的序列数≥20，同时要求覆盖度＞2%。

复旦大学附属中山医院的研究团队[17]定义的判断标准为，细菌(不包括分枝杆菌)、病毒和寄生虫其覆盖率比任何其他微生物高10倍；真菌覆盖率比任何其他微生物组高5倍。对于结核分枝杆菌如检测出唯一比对序列即作为阳性判断，但非结核分枝杆菌需排在所有微生物的前10名。

目前对NGS的报告解读未有统一的标准[14]，需结合临床特征综合判断。更精确有效的判断方法需要更深一步的研究证实。

5 结语

NGS 相对于病原学检测方法(如微生物培养技术、核酸扩增技术、血清学病原菌抗体检测技术及特定病原菌的多重PCR 技术等)，有检测范围广、检测种类多，无须培养、不受抗生素影响的优点，并能同时明确样本中的细菌、真菌、病毒及原虫，并且能够精确到种水平，还能够明确微生物的抗生素耐药等功能；且了解肺部菌群和呼吸道疾病的关联有一定意义。

对于胞内感染菌检测，如军团菌、结核分枝杆菌等，因其在胞外的含量较低，故而检测的敏感性偏低[26]。但随着技术的不断优化，NGS 对胞内感染菌诊断的敏感性会逐渐增高。而且其结果判读目前并无统一标准，需要临床医生结合患者的临床表现、采集样本类型、微生物背景、传统的病原体检测报告和辅助检查等判断是定植菌、背景菌还是致病菌。

总之，经过近些年来NGS 的不断应用，医学界进一步的认识了肺部的微环境，同时对肺部菌群和肺部疾病的关系有了新的见解。同时NGS 技术这一种新的检测手段，补充了临床上对不明原因感染、危重症及免疫低下患者的病原学检测方案，提高病原体的检出率，对帮助临床医生精准诊疗、减少广谱抗生素的经验性使用、降低重症患者死亡率有一定意义。