常用肝纤维化实验动物模型研究进展

王奎淞，赵鲲鹏，张秋菊

肝纤维化(HF)是慢性肝损伤导致肝内胶原纤维异常增生的病理过程。HF如未得到及时治疗，会发展成肝硬化甚至肝癌，严重影响人类健康[1]。HF动物模型是HF研究的必要工具，目前其模型制备方法较多，为了方便科研工作选择HF模型制备方法，本文将目前常用的制备方法做一介绍。

1 化学损伤HF模型

化学损伤HF模型是用化学药物进入肝细胞产生毒性代谢产物造成持续性肝损伤，诱导形成HF。常用肝毒性化学试剂有四氯化碳(CCl4)、二甲基亚硝胺(NDMA)和硫代乙酰胺(TAA)。

1.1CCl4诱导的HF模型 四氯化碳(CCl4)是具有微甜气味，无色透明易挥发的脂溶性有机化合物，可选择性损害肝细胞。当CCl4随血液循环进入到肝细胞后，会在肝细胞色素P450作用下，产生一系列自由基使细胞膜、内质网膜等发生氯烷基化和脂质过氧化，损伤膜的结构和功能，导致肝细胞死亡。CCl4造模法由于价格低廉、可靠性高、可重复性好的优势成为了目前使用最多的HF动物造模方法。适用于急性、亚急性、慢性肝损伤及肝纤维化、肝硬化的研究，且致病原因和病理表现适合用于反映中医湿热、气滞以及阴虚的病机，能为相关疾病的研究提供适宜动物模型[2]。CCl4诱导HF造模法选用的实验动物多为大小鼠，给药多采用灌胃和腹腔注射。腹腔注射法造模成功率高，造模周期短，但动物死亡率高；灌胃法操作简单，动物耐受性好，但造模周期长，造模成功较困难[3]。故目前多选腹腔注射方式造模。

1.1.1单纯CCl4诱导的HF模型：CCl4制备HF动物模型时，多选用200 g大鼠以50%CCl4油溶液腹腔注射或灌胃给药。单次给药剂量为1 ml/kg，每周2次，给药总剂量达1.6 ml时即可得到稳定的HF动物模型。一般给药4周后可观察到HF样改变，给药8周可持续观察到稳定的HF样改变[4]。

CCl4制备HF小鼠模型时多选用25 g小鼠，腹腔注射50%CCl4油溶液，单次给药剂量2 ml/kg，每周2次，为期6周，给药总剂量达0.6 ml时可得到稳定的HF模型；或选用50%CCl4油溶液，单次给药剂量0.5 ml/kg，每周2次，为期12周，给药总剂量达0.3 ml时可得到稳定的HF模型[5]。

1.1.2CCl4联合诱导的HF模型：目前CCl4联合苯巴比妥或乙醇制备HF动物模型已较成熟。苯巴比妥可提高细胞色素P450活性，增强肝细胞对CCl4的敏感度，加剧CCl4的毒性作用；乙醇能损伤肝细胞线粒体，加剧CCl4的肝毒性，促进肝损伤，最终形成稳定的HF模型[6]。但因CCl4给药剂量和干预时间不易控制，2种联合造模法常使实验动物进展为肝硬化甚至产生腹水，导致造模失败，故现多用于制备肝硬化和肝硬化腹水的动物模型[7]。

1.2NDMA诱导的HF模型 NDMA是能同时溶于水和乙醇的有机溶剂，可经消化道、呼吸道迅速吸收，进入体内可经多途径诱导肝损伤。此时，广泛的全小叶和多小叶坏死能唤醒静息的肝星状细胞转化为肌成纤维细胞，并开始广泛合成结缔组织蛋白，从而引起胶原纤维在肝细胞外基质沉积，导致HF[8]。选用NDMA作为HF动物模型造模试剂时，多选择大鼠，常用0.9%氯化钠注射液稀释0.5%NDMA溶液后以2 ml/kg剂量腹腔注射，每周连续注射3 d，3～4周造模成功[9]。虽NDMA诱导HF模型法稳定、成功率高，但因NDMA是有较强肝毒性的致癌物，近年被国家列为管制药物，且价格昂贵，不适合用于HF动物模型造模。

1.3TAA诱导的HF模型 TAA是具有肝毒性的有机化合物，能影响肝细胞蛋白合成，并于DNA、RNA及蛋白合成酶上产生毒性作用，诱导肝代谢紊乱及血小板降低[10]。TAA诱导的HF动物模型在血流动力学、生化指数改变及形态学方面与人类HF表现极相似[11]。用TAA制备HF实验动物模型时，一般选用啮齿类动物，采用灌胃、皮下或腹腔注射方式，将3%TAA溶液按150～200 mg/kg剂量给药，每周2～3次，造模周期一般>4周[12]。

饮用TAA溶液也可诱导HF形成，且模型持久性与TAA灌胃无差别[13]，但灌胃法诱导HF周期更短，造模用试剂摄入量更加可控，也不会出现拒饮情况，杜绝了因饮水量减少造成采血难度加大、饮水量不足导致的死亡；灌胃法还能有效杜绝因多次注射引发的局部感染，腹腔注射引起的腹腔内脏粘连或硬结形成，且更加接近人类HF形成途径[14]。

MATSUO等[15]为更加贴近临床，选用食蟹猕猴作为造模动物，将3%TAA溶液按100 mg/kg剂量皮下注射，每周3次，持续8周造模，给药4周后可观察到HF样改变，给药8周后可观察到纤维变性恶化，且通过组间对比，认为TAA优于CCl4，因其既可诱导HF进展，又能恶化残余的肝功能，且只有TAA给药能使吲哚菁绿清除功能恶化。但因模型动物的个体差异，非人灵长类动物(NHPs)对TAA的反应可能比啮齿类动物低得多，故需单独修改试剂给药方案，继续探索建立适宜所有NHPs的可用模型制备方案。但此方案只需8周就能建立HF模型，为现有NHPs模型中所需时间最短的。

2 膳食模型

许多疾病都受到饮食因素的影响，模拟日常生活膳食有助于制备的动物模型更加贴近人类疾病的临床表现。

2.1酒精诱导的HF模型 酗酒已是全球性医疗保健问题，全球超过5%的疾病是由酗酒引起[16]。肝脏是乙醇代谢的主要场所，乙醇代谢产物乙醛能诱导肝脏氧化应激，使线粒体和微管系统受损，线粒体功能损伤、内质网应激和免疫/炎症反应等引起肝损伤，故长期和(或)短期内大量酗酒会产生广泛的肝脏病变，使得酒精性肝病(ALD)发病率升高。

ALD的特征性表现是脂肪变性、肝炎和纤维化/肝硬化。脂肪变性是大量饮酒损伤肝脏后出现的最早征象，特征是脂肪在肝细胞内沉积。脂肪变性可继发为脂肪性肝炎，同时细胞外基质会出现蛋白过度沉积，甚至可能观察到过度的肝脏瘢痕组织形成和血管改变。瘢痕组织可减缓血液通过肝脏的流速，增加门静脉压力及毒素蓄积，导致肝衰竭[17]。

研究表明，由食用白酒替代医用乙醇溶液后，实验动物拒饮水现象减少[18]。故可用52°白酒灌服制备小鼠急性酒精性肝损伤模型，剂量12 ml/kg，每日1次，6～12 d可制备成功[19]。孙福荣[20]研究显示，单次狂饮比长期规律适量饮酒更易出现肝脏脂肪变，成为ALD的主要诱因。王秋艳等[21]研究也认为短期内大量饮酒会对肝脏组织造成损伤。故可选用12 ml/kg一次性灌服50%乙醇溶液来制备小鼠急性酒精性肝损伤模型，16 h便可建模成功。

2.2高脂饮食诱导的HF模型 非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)主要包括肝脂肪变性和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)[22]。NASH最常见纤维化征象[23]，故可用高脂饮食诱导建立HF模型。虽诱发NAFLD的机制及如何发展为NASH的机制目前尚未完全阐明，但有学者认为是多因素导致，如胰岛素促进葡萄糖摄取和利用率下降，脂肪在肝细胞内积累，细胞内脂肪空泡增多，线粒体β氧化能力降低，诱导内质网发生应激和肝细胞凋亡[24]。

目前，多使用含约40%脂肪和约0.2%胆固醇固定配比饲料放任模型大鼠随意饮食或选用高脂日粮，造模周期12周[25]，8～12周得到稳定脂肪性HF动物模型[26]，在此基础上添加果糖、游离胆固醇或CCl4能使实验动物模型在表现NAFLD某些特征时更为明显和突出[27]。高脂饮食诱导的非酒精性脂肪性HF模型与人类营养代谢紊乱相关的非酒精性肝炎致HF的病理过程最为贴近，该HF模型已较成熟，可为NAFLD相关疾病的HF样改变研究提供必要的工具。但因动物摄食量、时间等不易控制，使制备的HF模型个体差异较大。

2.3蛋氨酸-胆碱缺乏(MCD)饮食诱导的HF模型 长期营养不良或摄入不足会导致肝细胞损伤和脂肪变性，续而可发展为HF。经控制饮食摄入不平衡或缺乏特定营养素引起肝细胞脂肪变性，使肝细胞对各种有害因素的抵抗力降低，或使细胞体积增大彼此挤压并压迫肝血窦，逐渐造成肝细胞凋亡或纤维组织增生，进而形成HF。蛋氨酸是构成机体的必需氨基酸，能参与蛋白质合成，因不能由动物自身生成，故MCD饮食可致HF。MCD会严重影响肝β氧化、减少极低密度脂蛋白合成，造成肝损伤[28]。MCD模型能很好地复制人体严重NASH临床表征，且纤维化进展快[29]。

小鼠是MCD制备HF模型的首选，有关研究使用MCD饲料喂养C57BL/6小鼠6周后发现小鼠体内PAI-1、TGF-β1、α-SMA等促纤维化蛋白和基因水平升高，提示HF形成[30]。胱氨酸、维生素等其他营养因素可引起肝细胞坏死，进而发展为肝硬化，也可用于制造HF动物模型[31]。值得注意的是，MCD造模方案虽会导致模型动物体质量下降，但未见血清胰岛素、空腹血糖、瘦素和三酰甘油等降低[32]，和人类NASH表现还有一定差异，提示选用此造模方法尚需综合考虑存活率和病理特征。有研究发现，MCD诱导的3～5周龄幼鼠已可为儿童NAFLD研究提供合适的动物模型[33]。

3 自身免疫性HF模型

自身免疫性肝炎可在免疫或病毒感染等因素影响下诱使免疫细胞攻击自身肝细胞，致肝脏炎症性坏死，继而发展为HF、肝硬化等[34]。目前，该模型制备方法使用动物血清作为抗原反复注射引起肝细胞损伤或经手术胆总管结扎法以激活造模动物自身免疫反应，制备自身免疫性HF模型。

3.1猪血清诱导HF模型 猪血清是自身免疫性HF模型制备中最常用的异种血清，当其注入模型动物体内后，会刺激产生抗体形成免疫复合物(IC)激活补体，长期抗原刺激形成的IC会沉积于血管壁，引起变态反应造成血管炎和血管周炎，导致肝损伤，形成广泛的进行性慢性炎症，如此反复的肝细胞变性、坏死和增生，逐渐发展为纤维化样改变[35]。猪血清多为0.5 ml/只腹腔注射，每周2次，4周见HF指征，8周造模结束，12周时发现造模时间越久HF表现越明显[36]。研究显示，猪血清诱导的HF大鼠模型血液流变学表现十分符合中医“血瘀证”血行不畅和血不循经的特点[37]，这无疑为使用“活血化瘀”法治疗HF提供了有力证据。

3.2胆汁淤积性HF模型 胆汁淤积性肝病可导致肝细胞坏死、细胞凋亡、进行性纤维化甚至终末期肝病[38]。制造胆汁淤积性HF动物模型时，常使用胆总管结扎造模法，即选用8～12周雄性小鼠经手术激活其自身免疫反应制造HF模型。GARCIA-RUIZ等[39]使用2%异氟烷麻醉小鼠，沿腹中线开腹后钝性分离胆总管与门静脉及肝侧壁，于近肝门处双重结扎胆总管，并剪断胆总管确保完全阻断，生理盐水冲洗腹膜腔，缝合腹壁并予止痛药物。术后12、24 d取肝检测，可观察到丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶和总胆红素升高，苏木精-伊红染色、Masson染色和天狼猩红染色可观察到坏死、炎性细胞浸润、胆管增生和纤维化样变。胆总管结扎造模法操作简单，成模率高。但操作过程中需严格无菌操作，以避免术后感染，建议术中或术后予抗菌药物预防感染；操作人员操作应熟练、细致，以避免人为操作失误导致的胆汁或肠内消化液流入腹腔引发实验动物死亡。

4 小结

每种HF模型制备方法都存在不同的优缺点，需根据实验目的和要求选择合理的模型制备方法。因个体差异，模型动物对药物剂量的敏感度不同，建议首先行预实验摸索适宜剂量，切勿盲目模仿他人研究。因动物和人类必然存在生物学差异，动物模型永远不能完全表现出人类疾病的临床表现，但能帮助我们不断接近疾病的根本病因，直至攻克疾病。