腓骨杯桩菇基本营养成分和挥发性物质分析及评价

何轶榕，王术荣*，孟俊龙，常明昌

（1.山西农业大学食品科学与工程学院，山西 太谷 030800；2.黄土高原食用菌提质增效协同创新中心，山西 太谷 030800）

五台山地貌多样、气候清凉、台蘑资源丰富。台蘑包括大白桩菇、肉色杯伞、落叶杯伞、紫丁香蘑、垩白桩菇等，俗名有白银盘、红银盘、水皮子、小香蕈、大香蕈、虎皮台蘑等[1]。史光中等[2]研究了大白桩菇（白银盘）、肉色杯伞（红银盘）、紫丁香蘑（大香蕈）和垩白桩菇（小香蕈）等野生台蘑的营养成分，发现野生台蘑的营养价值很高，蛋白质含量大约占干物质的40%。罗明正等[3]全面分析评价了五台山大白桩菇（白银盘）、肉色杯伞（红银盘）、垩白桩菇（小香蕈）和紫丁香蘑（大香蕈）中蛋白质的营养价值，发现这4种野生台蘑中，肉色杯伞的蛋白质含量最高，其次是大白桩菇，紫丁香菇和垩白桩菇最低，但都比茶树菇和香菇的蛋白质营养价值要高。张芳雅等[4]对落叶杯伞（水皮子）的化学成分进行了研究，通过提取、分离及鉴定，从落叶杯伞（水皮子）中共得到10个单体化合物。本文对腓骨杯桩菇（Clitopaxillus fibulatus）的基本营养成分、氨基酸组成和挥发性物质进行测定分析，以期为腓骨杯桩菇的产品开发和深层次利用提供重要参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

腓骨杯桩菇（虎皮台蘑）于2019年8月18日采自山西省五台山自然保护区，编号G16174。将采回的新鲜子实体于65℃烘干箱中烘干，研磨机磨粉，过80目筛，装入塑封袋，4℃冰箱保存。

DNA试剂盒：美国OMEGA公司；琼脂：上海生物工程有限公司；HCl（分析纯）：成都市科隆化学品有限公司。

1.2 仪器与设备

Eclipse Ni-U光学显微镜：日本尼康公司；TB-214型电子分析天平：北京赛得利斯仪器系统有限公司；GZX-9240MBE型电恒温鼓风干燥箱：上海博讯实业有限责任公司；MultifugeX1R Centrifuge离心机：美国THERMO公司；KDN-1型全自动凯氏定氮仪：上海仪电科学仪器股份有限公司；Biochrom-30+全自动氨基酸分析仪：英国百康biochrom公司；StableFlex手动固相微萃取装置：美国Supelco公司；HP6890/5975C型气相色谱质谱联用仪：美国Agilent公司；Gel DOCTMXR+凝胶成像分析、C1000 TouchTM温度梯度基因扩增仪（polymerase chain reaction，PCR）：美国BIO RAD公司。

1.3 形态学分析

观察新鲜子实体的宏观形态并且拍照记录，于55℃烘干箱中烘干，制作标本，标本收藏于山西农业大学菌物标本馆（HMSAU）。将干标本徒手切片，在5%KOH溶液中复水，采用光学显微镜对复水后的切片观测其孢子、担子等显微结构[5]。

1.4 分子生物学鉴定

分子生物学鉴定步骤包括DNA提取、PCR扩增和测序。从干燥的真菌标本中提取基因组DNA，提取后测定DNA的浓度。PCR扩增遵循Vilgalys和Hester协议[6]进行扩增反应，在扩增反应中使用引物ITS8-F/LR3，对DNA的内转录间隔区（internal transcribed spacer，ITS）和核糖体大亚基区（ribosomal large subunit，LSU）进行扩增。将得到的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。

1.5 基本营养成分分析

蛋白质含量测定方法参照GB 5009.5—2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》[7]；脂肪含量测定参照GB 5009.6—2016《食品安全国家标准食品中脂肪的测定》[8]；灰分含量测定参照GB 5009.4—2016《食品安全国家标准食品中灰分的测定》[9]；总糖的测定采用徐显利等[10]的方法进行测定；多糖含量采用苯酚-硫酸法进行检测[11]。根据上述方法依次对腓骨杯桩菇的蛋白质、脂肪、灰分、总糖和多糖进行含量测定。

1.6 腓骨杯桩菇子实体的氨基酸检测及分析

使用分析天平称量子实体粉0.2 g，置于安瓿管中加6 mol/L HCl溶液定容至10 mL。通入氮气迅速封口后，置于110℃烘箱内水解22 h，将安瓿管取出后迅速冰水浴冷却至室温（25℃）。然后，将样品水解液经滤纸过滤后，用0.01 mol/L HCl定容至50 mL，准确吸取水解液2.0 mL，置于60℃下真空旋转蒸干；继续加入0.02 mol/L HCl溶液 2.0 mL，过 0.45 μm 滤膜，即得酸水解液。取20 μL水解液样品到氨基酸自动分析仪，分析样品蛋白中水解氨基酸的组成与比例含量；最后，根据氨基酸平衡理论世界卫生组织/联合国粮农组织（World Health Organization/Food&Agriculture Organization，WHO/FAO）的必需氨基酸模式，采用氨基酸的化学评分（amino acid score，AAS）来评价腓骨杯桩菇子实体的营养价值[12-13]。

1.7 腓骨杯桩菇子实体的挥发性物质检测及分析

1.7.1 固相微萃取（solid-phase microextraction，SPME）进样条件

准确称取烘干的腓骨杯桩菇子实体粉1.0 g，将其装入10 mL固相微萃取的样品瓶，放置于60℃恒温水浴摇床振荡30 min，取样前将萃取头放置在250℃的气相色谱进样口，老化30 min的萃取头并进行空白试验，直至无杂峰出现。然后，将SPME萃取头迅速插入样品瓶的顶空部分，在60℃下萃取吸附30 min后，抽回萃取头，再迅速插入气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）进样口，置于 250 ℃下解吸5 min后，进行GC-MS分析测定样品中挥发性风味物质。

1.7.2 气相色谱-质谱分析条件

气相色谱条件：TG-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）弹性毛细管柱；进样口温度250℃；载气为氦气，流速1.0 mL/min，不分流进样模式，随后进行程序升温；柱温起始温度35℃，停留3min，以5℃/min升至180℃，保持3min，然后再以10℃/min升至250℃，最后停留5 min。

质谱条件：电子轰击（electron ionization，EI）离子源，温度250℃，电子能量70 eV，传输线温度250℃，离子源四极杆温度150℃，质量扫描范围35 m/z～500 m/z，分析化合物CAS号经NIST和WLIEYT谱图库检索分析确认定性[14-15]。

1.7.3 挥发性物质检测数据分析

数据经过检索对比后选择匹配度大于800的结果进行确认，经计算机检索结合谱库确定其挥发性物质并用峰面积归一化法确定挥发性物质的相对含量，通过保留时间、质谱及化合物成分等参数进一步确定其挥发性物质[16-17]。

1.8 数据处理

采用Excel统计所有数据，并采用Origin软件进行绘图，所有试验重复3次。

2 结果与分析

2.1 形态学分析

腓骨杯桩菇的子实体形态见图1。

图1 腓骨杯桩菇的子实体Fig.1 Basidiomata of Clitopaxillus fibulatus

初期菌盖凸起，随着年龄的增长渐渐平展，中间略微凹陷，乳白色至浅褐色，边缘内卷，菌盖宽4 cm～10cm，具有同心皱纹或裂缝；菌褶弯生至延生，奶油色至淡黄色，有分叉，褶间有横脉；菌柄（4～10）cm×（1～3）cm，实心，圆柱形，黄白色至淡黄色，菌柄内部随着年龄的增长逐渐变成海绵状；菌肉气味浓厚。

担孢子（5.12～6.45）μm×（3.93～4.57）μm（n=20），（长宽比，Q）=1.30～1.41，（长宽比平均值，Qm）=1.36±0.10，宽椭圆形至椭圆形，壁薄光滑，无色透明。担子（23.5～37.6）μm×（4.8～6.4）μm（n=20），长棍棒状到接近圆柱形，有4个担子小梗，小梗长约5 μm。褶缘囊状体（30.34～9.67）μm×（7.46～8.12）μm。锁状联合存在于子实体的菌丝和基部，有时候呈现环形或者未封闭状态。菌丝细胞内带有褐色色素。

2.2 分子学鉴定

基于腓骨杯桩菇的ITS序列构建的ML系统发育树见图2。

图2 基于腓骨杯桩菇的ITS序列构建的ML系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree of Clitopaxillus fibulatus and rellated species based on ITS sequence

通过rDNA的ITS、序列比对和人工复检后，将序列在NCBI数据库中进行比对。并从构建的ML系统发育树分析，以灰乳牛肝菌Suillus viscidus（MZ005510.1）做外类群比对，本研究采集的G16174标本与已有相关研究的腓骨杯桩菇（Clitopaxillus fibulatus）模式标本ITS序列聚在一起，支持率高达100%，并且与褶桩菇属及近似属的其他物种分开。

2.3 腓骨杯桩菇基本营养成分分析

腓骨杯桩菇的主要营养成分分析见表1。

表1 腓骨杯桩菇的主要营养成分分析Table 1 Analysis of main nurition components of Clitopaxillus fibulatus

子实体干品中含有33.9%的蛋白质、5.9%的灰分、1.6%的脂肪、45.3%的总糖和4.32%的多糖。腓骨杯桩菇蛋白质含量是平菇的1.8倍，是香菇的1.7倍（平菇的蛋白质含量为19.08%[19]，香菇的20.3%[20]），其脂肪含量是平菇的0.9倍，是香菇0.5倍（平菇的脂肪含量为1.71%[19]，香菇的脂肪含量为3.4%[20]）。综上所述，腓骨杯桩菇的蛋白质含量较高，脂肪含量较低，营养价值丰富，是一种优质的植物蛋白的来源。

2.4 氨基酸组成分析及评价

2.4.1 氨基酸组成分析

腓骨杯桩菇氨基酸分析色谱图见图3。腓骨杯桩菇中氨基酸的组成与含量分析见表2。

图3 腓骨杯桩菇氨基酸分析色谱图Fig.3 Amino acid chromatograms of Clitopaxillus fibulatus

表2 腓骨杯桩菇中氨基酸的组成与含量分析Table 2 Composition and content analysis of Clitopaxillus fibulatus

腓骨杯桩菇经过酸水解后对其氨基酸种类及含量进行测定。测得的17种氨基酸（色氨酸除外）中，必需氨基酸有7种，非必需氨基酸有10种。必需氨基酸占总氨基酸含量的33.06%，必需氨基酸占非必需氨基酸含量的49.39%。在必需氨基酸中，赖氨酸的含量为33.53 mg/g，占必需氨基酸总含量的29.61%，可以补充人体赖氨酸的不足。腓骨杯桩菇子实体中含氮呈味氨基酸（谷氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、甘氨酸和酪氨酸）的总量为173.05 mg/g，占总氨基酸含量的47.09%。极其丰富的含氮呈味氨基酸，赋予腓骨杯桩菇良好的风味与鲜味，为开发天然呈鲜味物质及其功能性风味食品提供了理论依据[21-22]。

2.4.2 氨基酸评价

腓骨杯桩菇的氨基酸评价见表3。

表3 腓骨杯桩菇的氨基酸评价Table 3 Evaluation of amino acids of Clitopaxillus fibulatus

氨基酸评分主要反映的是食物蛋白中氨基酸含量与氨基酸评分模式中对应氨基酸需要量相比的满足程度。由表3知，腓骨杯桩菇氨基酸含量能满足FAO/WHO的成人推荐值[23-24]，其中赖氨酸高于成人模式推荐值的1.09倍，氨基酸评分高达2.10；苏氨酸高于成人模式推荐值的1.21倍，氨基酸评分高达2.21；苯丙氨酸+酪氨酸高于成人模式推荐值的0.58倍，氨基酸评分为1.58。因此可得，腓骨杯桩菇能满足成人对氨基酸的需求。

2.5 腓骨杯桩菇子实体挥发性物质分析

腓骨杯桩菇子实体中挥发性风味成分的GC-MS总离子流色谱图见图4。腓骨杯桩挥发性成分的GCMS鉴定结果见表4。

图4 腓骨杯桩菇子实体中挥发性风味成分的GC-MS总离子流色谱图Fig.4 Total ion chromatogram of GC-MS from volatile flavor components in Clitopaxillus fibulatus

表4 腓骨杯桩挥发性成分的GC-MS鉴定结果Table 4 Analytical results for GC-MS identification of volatile compounds in Clitopaxillus fibulatus

续表4 腓骨杯桩挥发性成分的GC-MS鉴定结果Continue table 4 Analytical results for GC-MS identification of volatile compounds in Clitopaxillus fibulatus

采用固相微萃取、气相色谱-质谱的方法分析腓骨杯桩菇的挥发性物质[25]。共检测出的58种化合物中醛、醇、酮、烷烃种类比较丰富，分别有12种、6种、7种、7种，其含量也比较高，分别占总挥发物质的31.08%、14.17%、7.42%、5.47%、6.43%。在醛类挥发物中，己醛的含量达到了15.05%，使子实体具有独特的油脂和苹果香气。其他挥发物质：酸类物质5种、吡嗪2种、酯类2种、呋喃1种，分别占总挥发物质的5.47%、3.77%、3.35%、12.70%。丰富的挥发物质构成了腓骨杯桩菇独特的风味，赋予其独特鲜味物质[26]。综上所述，这些主要的风味化合物与腓骨杯桩菇独特的香味有密切的联系。

3 结论

通过形态学和分子生物学分析验证了此种台蘑为腓骨杯桩菇，其子实体蛋白质、总糖、多糖含量比较高，分别占干样的33.9%、45.3%、4.32%，灰分和脂肪含量比较低，分别占干样的5.9%、1.6%。其蛋白质含量高于香菇和平菇，脂肪含量却低于香菇和平菇。子实体中氨基酸种类齐全，共有17种氨基酸，其中必需氨基酸占总氨基酸含量的33.06%，必需氨基酸占非必需氨基酸的49.39%，能满足FAO/WHO的18岁以上推荐值。含有的58种挥发物质中醛、醇、酮、烷烃种类比较多，醛类的挥发性物质含量高达31.08%，特别是己醛，达到了15.05%，赋予了子实体油脂和青草气及苹果香味，2-正戊基呋喃含量为12.70%，给予子实体独特的鲜味。综上所述，腓骨杯桩菇子实体是一种高蛋白、低脂、能满足人体需求、具有独特风味的食品原料，可进一步深层次开发台蘑风味食品和产品。