阿尔茨海默病早期诊断及新技术展望

纭玲 高洪梅 李硕 杨烁 王海涛 崔慧娟 刘焕亮 付源★

阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是一种以进行性记忆丧失和认知功能障碍为特征的神经退行性疾病［1］。细胞外β⁃淀粉样蛋白（amyloid beta，Aβ）沉积，细胞内神经原纤维缠结（Neurofibril⁃lary tangles，NFTs）伴神经元丢失及胶质细胞活化是AD 病理特征［2］。流行病学调查显示65 岁以上人群中每10 人就有一人患病，85 岁以上人群中每3 人就有1 个患者［3］。AD 已成为全球严重的医疗和社会问题之一，给社会和家庭造成了沉重的负担。目前对AD 尚无有效治疗方法，而早期诊断AD 有助于早期干预及延缓疾病进展。生物化学改变发生于临床症状出现前20年，所以检测生物标志物是AD早期诊断的重要工具［4］。本文就AD 早期分子诊断研究进展进行综述，以帮助早期治疗、早期预防。

1 基因检测

AD 根据发病年龄分为早老性AD（early⁃onset AD，EOAD）与迟发型AD（late⁃onset AD，LOAD），EOAD 占所有AD 病例5%以下，LOAD 占所有AD病例的95%以上［5］。研究发现EOAD 主要由β⁃淀粉样蛋白前体（APP）、早老素⁃1（PSEN1）和早老素⁃2（PSEN2）基因突变引起，这些错义基因可协助早期诊断AD［6］，其突变之后可导致脑组织发生氧化损伤，引起脑内Aβ 的产生和清除的失平衡，进而形成Aβ 异常沉积所形成的老年斑（Amyloid Plaque），最终出现神经元凋亡［7］。基因突变的分类目前仍然具有挑战性，多项研究发现不同EOAD患者体内存在多个突变，如PSEN1的两个新突变（Y256N 和H214R）、致病性PSEN1Trp165Cys 突变、PSEN1G209A 突变，这些基因突变位点的筛查可为临床早期诊断AD 提供突变序列，未来还将从蛋白质组学、转录组学技术同步检查，并整合这两个组学分析的数据进一步研究其可能的致病机制［8⁃11］。

载脂蛋白E（Apolipoprotein E，APOE）基因被广泛认为是LOAD 的易感基因，其中APOE ε4等位基因是LOAD 发病的最强风险因素，与AD 大脑中Aβ 异常沉积密切相关［12］。携带APOE ε4基因亚型的AD 模型小鼠脑内Aβ 的异常沉积主要发生在Aβ 形成早期，而不影响中晚期Aβ 沉积［13］。脂质化apoE 与Aβ 竞争性结合细胞膜表面HSPG 受体，抑制神经细胞摄取Aβ，导致Aβ 清除减慢，此作用具有浓度依赖性［14］。APOE ε4转基因小鼠中炎症因子环孢素A 和基质金属蛋白酶⁃9 通过加速血脑屏障周细胞的降解，引起血脑屏障破坏，进而影响血脑屏障介导的外源性Aβ 的清除［15］。此外，APOE ε4激活Erk 途径、降低细胞自噬清除tau 蛋白、诱发肿瘤坏死因子⁃α 分泌产生炎症反应等途径加剧tau 蛋白异常磷酸化，导致神经元退行性改变［16］，这些关键的病理变化可协助早期筛查LOAD 患者。

全基因组关联研究证实了CD33基因与AD 发病具有关联性，其表达的CD33 蛋白在大脑中主要由小胶质细胞表达，对小胶质细胞介导的Aβ 的摄取发挥抑制作用，是LOAD 易感基因位点，利用静息状态功能磁共振成像发现CD33基因型主要影响额叶⁃纹状体环路中脑功能，在海马旁回中也观察到CD33基因型和AD 之间存在相互作用，这些发现为CD33基因型对认知功能的影响提供了进一步的见解［17⁃18］。此外，还有研究发现携带微管相关蛋白tau（Microtubule⁃associated protein tau，MAPT）基因患者脑脊液t⁃tau 和p⁃tau 水平显著增加，表明MAPT基因可作为早期诊断AD 有效的筛查基因，但仍需要进一步明确其基因多态性与AD 发病风险的相关性［19］。所以验证这些基因准确预测疾病发生的能力并明确可能的致病机制非常重要。

2 生物学标志物检测

AD 相关生物学标志物检测主要以脑脊液检查为主，随着技术手段的进步，在外周血液等其他组织也正在试图寻找简便有效的早期诊断生物标志物。根据国际工作组织和美国国立老化研究院建立的诊断标准，脑脊液Aβ1⁃42水平下降、总tau、磷酸化tau 水平上升被认为是有效的AD 支持性诊断标准之一。Lewczuk 等人［20⁃21］报道脑脊液中Aβ42 降低对AD 诊断的敏感性为69.3%，特异性则可达到88.9%，Aβ42/Aβ40 降低的敏感性和特异性分别为93.3%和100%，在临床常规条件下脑脊液Aβ42/Aβ 40 代替Aβ42 可以提高诊断准确性，然而脑脊液生物标志物的可变性太高（包括运输、实验方法、参考值等的影响），临床界限值确定存在较大困难，下一步需要标准化实验室条件，识别和连续优化影响因素。Aβ1⁃42和p⁃tau 是脑脊液生物学标志物的最佳组合，可以预测轻度认知功能障碍患者发生AD 的总体风险，有利于对AD 患者进行早期干预［22］。视锥蛋白样蛋白1（Visinin⁃like protein⁃1，VILIP⁃1）是一种神经元内钙传感蛋白，在脑损伤模型和基因阵列分析中已被证实可作为神经元损伤的指标，其可作为神经元丢失病理过程的累积结果。因此，捕捉神经元变性丢失的脑脊液标志物可能对未来的认知下降提供预测价值。据此，有研究发现脑脊液VILIP⁃1 水平与情景记忆和语义记忆能力下降有关，与AD 早期颞叶内侧萎缩病理改变具有一致性，CSF 中VILIP⁃1和VILIP⁃1/Aβ42 可作为早期AD 患者认知功能下降的预测模型，其作用与tau 和tau/Aβ42 类似，可能成为AD 早期神经变性的有效CSF 替代物［23］。

由于脑脊液检测的有创性和普及难度大，而血液采集具有极大的简便性，大家开始把目光转向血液生物标志物。由于血浆中Aβ 的含量较低，且干扰测量的特定血液蛋白质和其他化合物含量过高，其免疫测量和定量受到阻碍。在极轻微AD、轻度认知功能障碍（Mild cognitive impair⁃ment，MCI）和健康对照组的血浆中检测t⁃tau 和p⁃tau蛋白水平，发现极轻微AD 和MCI 患者血浆t⁃tau和P⁃tau 水平高于健康对照组，极轻微AD 患者血浆t⁃tau 和p⁃tau 水平高于MCI 组，并且p⁃tau 相关性更显著，表明血浆t⁃tau 和p⁃tau 均可协助筛查早期AD，但血浆p⁃tau 水平与AD 严重程度相关性高于血浆t⁃tau［24］。此外，有研究还发现血清t⁃tau 和p⁃tau181 蛋白水平与蒙特利尔评分呈负相关，此结果支持血液t⁃tau 和p⁃tau 作为早期AD 的预测标志物，有可能作为未来随访AD 患者预后的指标［25］。分析MCI 和AD 患者血浆Micro RNA 转录组，microRNA⁃206 表现出与认知能力下降和记忆缺陷的强烈相关性，五年以上的纵向随访发现，microR⁃NA⁃206 在认知功能障碍发生之前异常增加，可用于预测MCI 阶段认知能力的下降［26］。

唾液生物学标志物检测是一种比血液更为简便的方法，利用高度敏感的Luminex 分析法对唾液t⁃tau、p⁃tau 和Aβ42 蛋白水平进行定量评估，结果显示AD 患者的p⁃tau/t⁃tau 比值显著增加，在S396 磷酸化位点变化更明显［27⁃28］。这些结果表明，唾液tau 蛋白可能成为AD 早期诊断的生物学标志物，甚至可应用于无症状受试者的筛查，进而为AD 治疗提供更大的时间窗［29］。此外，研究还显示AD 患者的唾液Aβ42 水平明显高于对照组［30］。综上所述，唾液检测可成为AD 早期诊断的关键方法。下一步有必要进一步了解这些生物标志物的联用优势，进行大样本数据验证及建立可靠的临界值和标准参考物。

3 影像学检查

影像学技术发展对AD的诊断和预后判断具有重要意义。AD 患者磁共振成像（Magnetic Resonance Imaging，MRI）检查的主要改变是皮质性脑萎缩和脑室扩大伴脑沟裂增宽，但由于缺乏对AD 诊断的特异性，主要用于排除可引起痴呆的其他疾病。定量磁化率成像是磁共振成像中一项新兴的用于定量测量组织磁化特性的技术，利用该技术证明Aβ 具有抗磁性，可在磁化率图上产生强烈的对比，磁化率标测可以用来检测AD 小鼠模型中Aβ 斑块的聚集［31⁃32］。

正电子发射断层扫描淀粉样蛋白显像剂与大脑内纤维状淀粉样蛋白沉积的结合，可视化和量化大脑内淀粉样蛋白沉积，可检测AD 患者大脑内Aβ 异常沉积，主要配体包括11C 和18F 标记的放射性示踪剂［33］。利用突触囊泡糖蛋白2A PET 显像测定突触密度，可为阿尔茨海默病的早期诊断提供工具［34］。氟⁃2⁃脱氧⁃D⁃葡萄糖⁃正电子发射断层扫描成像显示，颞顶叶、额叶和后扣带皮质中的葡萄糖代谢减少是AD 的标志，中晚期出现额叶皮质受累，额叶受累与否，可作为鉴别AD 早期和中晚期的标志［35］。应用单光子发射计算机断层扫描（Single Photon Emission Computed Tomography，SPECT）技术评估脑灌注变化，发现≥94%轻度AD患者的灌注值低于健康对照组的平均值，这一结果提示绘制低灌注的地形图，可明确特定的早期灌注模式，帮助早期诊断AD［36］。由于目前还没有确切规范的测量标准及相关案例较少，下一步需要建立供临床使用的标准并培训阅片人。

4 新技术展望

随着视觉变异型AD（Visual variant of AD，VVAD）患者的发现，眼部标志物逐渐进入研究者的视线，有研究团队发现AD 神经病理学包括视网膜Aβ、tau 蛋白的积聚、神经元丢失和RGC 凋亡，在AD 模型小鼠中发现其视网膜RGCc 层凋亡细胞的存在，视网膜凋亡细胞检测技术是一种利用放射性annexin V 和聚光共聚焦扫描眼底镜检测凋亡细胞的方法，可以在AD患者中无创性显示AD病理变化，这种成像技术的演变和发展可成为未来的AD诊断工具［37⁃38］。

生物传感器是一种对生物物质敏感并将其浓度通过识别元件识别后经换能器转换为光、电等可测量信号进行检测的仪器，因其快速、低廉、简便、可重复使用等优点成为诊断很多疾病的有前途的工具［39］。一种用于检测Aβ 蛋白的免疫磁生物传感器，利用sulfo⁃SMCC 交联法将抗Aβ 抗体标记在磁性氮掺杂石墨烯表面，形成磁性免疫载体，将磁性免疫载体放置在Au 电极上，在电极下方放置一个外部磁铁进行电化学Aβ 检测，通过电流变化测定Aβ 蛋白浓度，该仪器目前只在体外实验进行验证，未来可考虑对AD 患者脑脊液、血液Aβ 蛋白浓度进行测定，对AD 早期诊断有潜在的作用［40］。虽然这些技术优势显而易见，但同时也需要解决可再生性、特异性、稳定性等方面的问题，才可能使其成为未来的有效诊断工具。

5 结语

AD 目前尚无有效的治疗手段，早期诊断和干预是控制AD 发生发展的重要措施。建立有效的分子诊断标志物是AD 研究领域的重要难题。随着医疗新技术的不断发展，进一步发现有良好重复性及有效性，确立简便、易行的诊断方法，将会为AD 诊断指明新方向。