N6⁃甲基腺嘌呤RNA修饰在泌尿系统肿瘤中的研究进展

李金珂 袁焰

2019年1月国家癌症中心发布了2015年恶性肿瘤流行情况分析，结果显示主要的泌尿系肿瘤按发病率顺序排列为前列腺腺癌、膀胱（或肾盂输尿管）癌、肾细胞癌、睾丸癌和阴茎癌［1］。阐明表观遗传改变的原因和结局是了解癌症发生和发展的重要前提。“表观遗传学”的概念旨在解释在胚胎发育和组织动态平衡期间，如何从同一基因组产生不同的细胞表型。虽然表观遗传学的全部范围尚未确定，但通常被定义为化学修饰，主要包括DNA 和RNA 甲基化、组蛋白修饰、非编码RNA 修饰和染色质重排。

DNA 甲基化和组蛋白修饰已经得到了很好的研究。而在近十年里RNA 甲基化已经成为生物科学中的一个热门话题。常见的RNA 甲基化位点包括5⁃甲基胞嘧啶、7⁃甲基鸟嘌呤、1⁃甲基鸟嘌呤、2⁃甲基鸟嘌呤、6⁃甲基鸟嘌呤、N1⁃甲基腺嘌呤和N6⁃甲基腺嘌呤（N6⁃methyladenine，m6A）。m6A 是各种RNA 甲基化修饰中最常见的，其在肿瘤的发病机制中起着关键作用［2］。本文就m6A 修饰与泌尿系统肿瘤的关系，特别是其作为泌尿系统肿瘤生物标志物和治疗靶点的作用和机制作一综述，旨在为临床诊断治疗泌尿系肿瘤提供新的方向。

1 m6A 修饰机制

m6A 修饰是动态和可逆的，主要由“写入器”、“擦除器”和“阅读器”介导发挥生物学效应。可逆性意味着RNA 可以在甲基转移酶催化作用下甲基化，在去甲基酶催化作用下去甲基化，这种现象称为动态平衡。“写入器”，由甲基转移酶样3（methyltransferase like 3，METTL3）、甲基转移酶样14（methyltransferase like 14，METTL14）及相关辅助因子RNA 结合序列蛋白15（RNA binding mo⁃tif protein 15，RBM15）、Wilms 肿瘤相关蛋白（Wilms tumour 1⁃associating protein，WTAP）和vir样m6A 甲基转移酶相关蛋白（vir like m6A methyl⁃transferase associated，VIRMA）共同组成了m6A甲基转移酶复合物（methyltransferase complex，MTC）［3］。“擦除器”，即去甲基化酶，主要包括肥胖相关蛋白（Fat mass and obesity associated protein，FTO）和AlkB 同系物5（AlkB Homolog 5，ALK⁃BH5），催化去除RNA 的m6A 修饰［3］。另一个重要的家族是阅读器，它可以识别m6A 修饰，与其绑定，并执行不同的生物学功能［4］。阅读器主要为含有YTH 结构域的蛋白质。“阅读器”可以促进RNA的衰减或增强RNA 的稳定性，促进翻译，并影响各种靶mRNA 的剪接和核输出［5］。

2 m6A 修饰在前列腺癌中的研究进展

2015年全国前列腺癌总发病率为10.23/10 万较2011年总发病率7.1/10 万呈现上升趋势，发病率处于泌尿系统肿瘤中第一位［1］。使用血清PSA 检测前列腺癌缺乏敏感性和特异性，导致频率相对较高且不必要的前列腺穿刺活检。对于晚期转移前列腺癌患者，大约30%的患者进展为去势抵抗型前列腺癌（castration resistant prostate cancer，CRPC）。解决这些困境需要开发更多有效的分子标记物［6］。

多个课题组发现m6A 修饰水平在前列腺癌中呈现增高趋势［7⁃9］，尤其是骨转移的患者［10］。有研究人员在CRPC 的中检测到m6A 修饰水平升高和VIRMA 过表达；功能上，VIRMA提升m6A 修饰水平，促进致癌lncRNAs CCAT1和CCAT2的表达，增强前列腺癌的侵袭性表型［11］。

对于前列腺癌患者预后的判断，m6A 修饰相关调控基因同样扮演着重要的角色。多项研究表明单基因METTL3或VIRMA的高表达预示着前列腺癌患者预后不良［7⁃11］。或许单基因判断预后缺乏特异性，同样存在研究提示VIRMA、CCAT1和CCAT2作为一组变量，或者IGF2BP3、核不均一核糖核蛋白A2/B1（heterogeneous nuclear ribonucleo⁃protein A2/B1，HNRNPA2B1）、METTL14和拷贝数变异的ALKBH5作为基因组合，它们的表达是前列腺癌患者预后的独立预测因素［11⁃12］。

3 m6A 修饰在膀胱癌中的研究进展

膀胱癌是我国泌尿外科临床上最常见的肿瘤之一，2015年全国男性膀胱癌总发病率为8.83/10万［1］。目前诊断膀胱癌最可靠的方法是侵入性的膀胱镜检，因此迫切需求非侵入性筛查和诊断方法。

研究发现mRNA 的动态m6A 修饰及其调控蛋白在膀胱癌的恶性转化、生长、进展、化疗药物的敏感性等方面发挥关键作用［13⁃17］。具体机制上，METTL3和ALKBH5介导CUB 结构域蛋白1（CUB domain containing protein 1，CDCP1）mRNA的m6A 修饰，而阅读器YTHDF1优先识别CPCP1mRNA 上的m6A 位点，促进CDCP1翻译，促进化学致癌物诱导恶性转化细胞和膀胱癌细胞的生长和进展［15］。同样存 在METTL3/YTHDF2⁃m6A 修饰调控通路，其通过直接降解抑癌基因SET 结构域蛋白7（SET domain containing 7，SETD7）与Kruppel 样因子4（Kruppel like factor 4，KLF4）的mRNA，促进膀胱癌的进展［17］。进一步研究确定AF4/FMR2 家族蛋白4（AF4/FMR2 family member 4，AFAFF4）、MYC、NF⁃κB途径的两个关键调控因子（IKBKB和RELA）为METTL3介导的m6A 修饰的直接靶点［13］。METTL3和ALKBH5协同调节使m6A 修饰在整合素亚基6（integrin subunit alpha 6，ITGA6）转录本中高度富集，YTH 结构域家族蛋白1（YTH domain family protein 1，YTHDF1）和YTH 结构域家族蛋白3（YTH domain family pro⁃tein 3，YTHDF3）与其结合，促进ITGA6mRNA 的翻译，影响膀胱癌细胞的粘附、迁移和侵袭表型［14］。一项研究发现FTO具有抑制膀胱癌细胞增殖和迁移的功能，同时FTO具有加强化疗药物顺铂对膀胱癌的细胞毒性作用［16］。这些特异性调控机制为膀胱癌的潜在治疗靶点提供了新的见解。

肿瘤细胞中一小部分具有长期致瘤能力的细胞，即肿瘤起始细胞或肿瘤干细胞，在癌症的发展和治疗抵抗性中起着关键作用，是导致肿瘤复发、转移的根源。多项研究发现m6A 修饰在调控膀胱肿瘤起始细胞或肿瘤干细胞中起关键作用［18⁃19］。METTL14和m6A 修饰参与NOTCH 受体1（notch receptor 1，NOTCH1）mRNA 的RNA 稳定性，而NOTCH1在膀胱肿瘤起始细胞的增殖、自我更新、转移和肿瘤发生能力中起重要作用。METTL3调控AFF4mRNA 上m6A 修饰，进而促进AFF4的表达，AFF4与SRY⁃box 转录因子2（SRY⁃box tran⁃scription factor 2，SOX2）和MYC基因启动子区域相结合，促进SOX2和MYC的转录表达，增强膀胱肿瘤干细胞的自我更新及体内的致瘤能力。

RNA m6A 修饰不单单调控mRNA 的表达，在特定的环境下也影响非编码RNA 的成熟。研究人员第一次发现METTL3通过调控非编码RNA 中m6A 修饰影响肿瘤形成［20］；研究通过证实METTL3可能通过与微处理器蛋白（microproces⁃sor complex subunit，DGCR8）相互作用，并以依赖m6A 的方式正向调节pri⁃miR221/222成熟，进而导致磷酸酯酶与张力蛋白同源物（phosphatase and tensin homolog，PTEN）的表达降低，最终在膀胱癌中发挥致癌作用。

4 m6A 修饰在肾细胞癌中的研究进展

肾细胞癌是一种从分子水平、基因组水平、组织病理学水平和临床水平上都具有很强异质性的恶性肿瘤。目前，临床尚无广泛接受用于肾细胞癌诊断和监测的肿瘤标志物。而如果能早期发现和监测这种隐匿性实体恶性肿瘤将有效改善其预后。一项研究首次绘制了人肾透明细胞癌m6A 修饰全转录组图谱，为阐明m6A 介导的基因表达调控机制奠定了基础［21］。

研究提示METTL3可能是肾细胞癌发生、发展和预后的一个新的标志物［22］。METTL3通过调控上皮细胞⁃间质转化（epithelial mesenchymal tran⁃sition，EMT）和PI3K⁃Akt⁃mTOR 通路来抑制细胞增殖、迁移和侵袭功能，减少细胞G0/G1 阻滞，并减缓体内肾细胞癌的生长。METTL14的表达与肾透明细胞癌患者临床病理分期呈负相关，与患者总生存期呈正相关，有潜力作为肾透明细胞癌的临床生物标志物［23］。同样有研究人员证明，METTL14调控嘌呤受体P2X 6（purinergic receptor P2X 6，P2RX6）mRNA 上m6A 的修饰，影响P2RX6的翻译，而ATP 可以可能通过P2RX6促进肾癌细胞的进展［24］。进一步研究表明ATP⁃P2RX6可能通过调节Ca2+介导的p⁃ERK1/2/MMP9信号通路，促进肾癌细胞的迁移和侵袭［24］。研究人员将亚甲基四氢叶酸脱氢酶2（methylenetetra⁃hydrofolate dehydrogenase 2，MTHFD2）介导m6A修饰和肿瘤细胞的代谢状态联系起来［25］。MTHFD2，一个参与单碳代谢的线粒体酶，促进缺氧诱导因子2α（hypoxia inducible factor⁃2α，HIF⁃2α）mRNA 的m6A 修饰，增强HIF⁃2α翻译；而HIF⁃2α翻译的增强反过来可以促进有氧糖酵解，在肾细胞癌中能够形成一个正的前馈回路，促进代谢重编程和肿瘤生长。

m6A 去甲基酶ALKBH5和FTO同样在肾透明细胞癌中异常表达，为判断预后和开发有效的靶向治疗提供了策略［26⁃27］。细胞中过表达FTO降低PPARG 共激活剂1α（PPARG coactivator 1 alpha，PGC⁃1α）mRNA 转录本中m6A 修饰水平，增加PGC⁃1α 的表达，从而恢复线粒体活性，诱导氧化应激和活性氧自由基的产生，并抑制肿瘤生长。同样ALKBH5通过依赖m6A修饰的方式稳定AURORA激酶B（aurora kinase B，AURKB）mRNA，调节AURKB的表达，体外促进肾癌细胞的增殖、集落形成、迁移和侵袭，并促进体内肿瘤的生长［28］。

随着生物信息学技术的发展，越来越多的研究集中在多基因模型对肿瘤进行早期检测和预测肿瘤的复发、进展和转移。多项研究从肿瘤基因组图谱（the caner genome atlas，TCGA）数据库中提取m6A 修饰调控分子的表达数据及其相关的临床信息，结果显示m6A 调控分子在不同临床病理特征的肾细胞癌中存在差异表达［29⁃32］。调控机制上双基因表达情况与癌症相关的途径、生物学过程和标志方面显著相关，包括“细胞粘附分子（cellular adhe⁃sion molecules，CAMs）”、“白细胞迁移”、“Wnt/b⁃catenin 信号”［29］。一组研究人员还构建包括MET⁃TL3、METTL14和HNRNPA2B1三基因风险评分模型，该模型可以预测TCGA 患者的总生存期［31］。这些基于生物信息学的研究旨在建立和验证m6A 相关的风险基因作为肾透明细胞癌患者的预后因素。

5 m6A 修饰在睾丸癌中的研究进展

睾丸生殖细胞瘤在20～40 岁的年轻男性中非常普遍，是这个年龄男性中最常见的致命实体瘤之一。甲胎蛋白和人绒毛膜促性腺激素是睾丸癌诊疗计划的重要生物标志物，特别是对睾丸生殖细胞癌患者的随访，但敏感性低（<50%）限制了它们的应用。表观遗传学对于睾丸癌诊断和疗效评估的潜在效能目前正在研究中。

一项研究为进一步的破译m6A 修饰在睾丸生殖细胞瘤中的作用提供了起点［33］。METTL3、ALKBH5、YTH 结构域包含蛋白1（YTH domain containing protein 1，YTHDC1）、YTHDF1、YTHDF2和不均一核糖核蛋白C（heterogeneous nuclear ribo⁃nucleoprotein C，HNRNPC）是睾丸生殖细胞瘤中m6A 修饰的主要写入器、擦除器和阅读器。一项研究结果表明METTL3通过调节EMT 相关基因的表达参与睾丸生殖细胞瘤细胞的增殖、迁移和侵袭，并可能在激活睾丸生殖细胞瘤的肿瘤免疫应答中发挥作用［34］。证实METTL3可以作为睾丸生殖细胞瘤患者的独立预后标志物。另外，研究人员确定VIRMA和YTHDF3通过依赖m6A 修饰调控促进精原细胞瘤形成，并且两者表达水平的高低可作为准确区分了精原细胞瘤和非精原细胞瘤，成为睾丸生殖细胞瘤患者新的候选生物标志物［35］。

6 展望

在泌尿系恶性肿瘤患者中检测到失调的m6A修饰水平以及异常表达的m6A 相关调控通路的结果为泌尿系肿瘤提供了新的研究方向。m6A 修饰调控分子在泌尿系肿瘤的发生、发展过程中起重要作用，为理解泌尿系肿瘤表观遗传调控提供了新的视角。调控分子及新的信号通路可作为泌尿系肿瘤患者预后分层的潜在生物标志物，有助于开发一种新的方法来更好地抑制肿瘤的进展，并可帮助临床医生实现群体患者的精准治疗。

然而，癌症表观遗传学的研究仍处于起始阶段。从上述有限的研究表明m6A 相关调控基因在泌尿系统肿瘤中有不同的表达模式。即使相同的肿瘤类型，调控机制却不同，可能的原因是由于研究队列的方法学差异和组织学模式的差异。因此，需要更多高质量的研究来比较这项或这组生物标记物在每个病例中的敏感性、特异性、阳性和阴性预测价值；并分析其在大的临床环境中从有限的样本中得出的结果是否具有有效的价值及可重复性。以期达到使m6A 修饰相关分子靶标被临床应用，朝着精准靶向治疗的方向迈出一大步。