广西猕猴桃春季病害鉴定

李文艺,李洁维,王发明,张 晋,钟彩虹*,李 黎*

(1.植物种质创新与特色农业重点实验室，中国科学院 猕猴桃产业技术工程实验室，中国科学院 武汉植物园，武汉 430074；2.广西壮族自治区中国科学院广西植物研究所，桂林 541006；3.广西壮族自治区农业科学院，广西 南宁 530007)

广西壮族自治区野生猕猴桃资源丰富，气候适宜猕猴桃生长，且果实成熟期较其他产区提前了15～20 d，具有较好的产业发展条件[1].20世纪80年代，广西各地开始种植猕猴桃，引导农民脱贫致富.据2021年6月统计数据显示，广西2020年猕猴桃种植面积已达0.53万hm2，结果面积为0.20万hm2，年产量为1.5万t；超越安徽、广东等老产区，位列中国猕猴桃主栽省份的第11位[2].目前，桂林市资源县、龙胜县，河池市南丹县及百色市乐业县等地均已发展成为全国猕猴桃种植的主产县区.

然而，伴随着广西猕猴桃产业的迅猛发展，病害问题也逐渐显现[3].自2013年初，相关科研院所逐步展开了研究.陈唯王[4]、黄继魁[5]及黄冬丽等[6]对乐业县猕猴桃的栽培现状及病害年发生动态进行了分析，认为当地主要病害为根腐病、褐斑病、溃疡病及白粉病，并编制了乐业县猕猴桃全年栽培管理与病虫害防治月历.莫晓云[7]分析了资源县主要病害溃疡病、褐斑病、根腐病及花腐病的防治技术.陈艳萍[8]结合龙胜县红阳猕猴桃黑斑病的症状及发生规律，探讨了防治措施.但目前暂未见对广西主栽区域进行系统病害调研及鉴定的报道.

为进一步全面了解广西猕猴桃产业现状及春季病害感病情况，2021年4月，中国科学院武汉植物园联合广西植物研究所、广西农业科学院对桂林市资源县和龙胜县、河池市南丹县及百色市乐业县等主产县园区进行了病害调研；通过典型病害样本采集及病原鉴定，全面分析了广西各主栽区域的春季病害种类及致病菌类型，为当地猕猴桃病害的预测及防治奠定了理论基础.

1 材料与方法

1.1 感病样本采集

2021年4月，中国科学院武汉植物园与广西植物研究所、广西农业科学院联合，对14个采样点进行了园区春季病害调研，观察到典型的细菌性溃疡病、真菌性灰霉病和病毒病等症状.同时，采集到33份疑似感病的叶片作为实验材料.各采样点具体地理位置见表1.

表1 14个采样点的具体地理位置

1.2 病菌分离、培养及鉴定

1.2.1 细菌性病原菌的分离及分子鉴定 取3片直径1 cm的病健交界处的叶片组织，用75%乙醇消毒后装入600 μL 10 mmol/L MgSO4的1.5 mL离心管中，研磨匀浆.吸取100 μL菌悬液涂布于LB平板上，28 ℃培养2 d.各样本3个重复.挑取单菌落，采用百泰克试剂盒提取细菌基因组，用16S引物27F(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG) 和1492R(GGTTACCTTGTTACGACTT) 进行PCR扩增.扩增体系为40 μL：10× PCR buffer 4 μL，5 U/ μL Taq酶0.25 μL，10 mmol/L dNTP 0.8 μL，1.10 g/mL DMSO 0.8 μL，100 μmol/L正反向引物各0.2 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 31.75 μL.PCR反应程序为94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃ 10 min.扩增产物送至华大基因公司测序后进行Blast比对及同源性分析，确定菌株的分类地位.

1.2.2 真菌性病原菌的分离及分子鉴定 取3片直径1 cm的病健交界处的叶片组织，用75%乙醇消毒后将叶片置于PDA平板上25 ℃培养5 d，选取菌丝尖端置于PDA平板上获得纯菌株并重新培养，25 ℃静置培养8 d后收集菌丝.每个样本3个重复.采用上海生工试剂盒提取真菌基因组，运用ITS4/ITS5引物进行扩增(ITS5-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG;ITS4-TCCTCCGCTTATTGATATGC)，扩增体系与1.2.1类似，具体参照White等[9].

1.2.3 病毒检测 取感病嫩叶0.1 g，采用液氮研磨后快速转入装有1 mL RNA提取缓冲液的1.5 mL离心管中，充分混匀后室温静置5 min，离心，将上清液用氯仿抽提2次，加入1 mL异丙醇沉淀核酸，收集沉淀物后用75%乙醇洗涤2次，风干后溶于30 μL DEPC处理水中，提取的RNA存于-20 ℃中备用.以RNA为模板，合成cDNA第一链.反应体系为20 μL，含5× 反转录buffer 4 μL，2.5 mmol/L dNTPs 1 μL，RNA酶抑制剂(40U/ μL)0.5 μL，M-MLV(200 U/μL)0.5 μL，随机引物(100 pmol/μL)1 μL、RNA模板5 μL和DEPC处理水8 μL.随后基于各病毒的特异性引物进行RT-PCR检测，对产物进行测序分析.以CLBV病毒为例，引物为(CLBV1F-AGCCATAGTTGAACCATTCCTC;CLBV5R-GCAGATCATTCACCACATGC)，PCR反应总体系为25 μL，含10× Taq DNA聚合酶缓冲液2.5 μL，10 mmol/L dNTPs 0.5 μL，5 U/μL Taq DNA聚合酶0.25 μL，10 mmol/L正反向引物各0.5 μL，cDNA 2 μL和灭菌去离子水18.75 μL.PCR反应程序为94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，35个循环；72 ℃延伸10 min.病毒的鉴定按照郑亚洲等[10]、朱晨熹等[11]及黄显德等[12]方法进行.

1.3 致病力测试

对于溃疡病菌，制备浓度为109CFU/mL的菌悬液；对于真菌菌株，将叶片和果实的表面用75%酒精消毒后，用2号解剖针进行针刺(果实刺伤深度2～3 mm)，制备直径5 mm的培养7 d的菌饼，将菌饼接种于伤口处，菌丝面朝下，覆盖湿棉球，并放入透明盒中密封保湿，6 d后观察发病情况.从病斑处再次分离培养病菌，与原接种菌株进行比较鉴定，确定是否符合柯赫氏法则.

2 结果与分析

2.1 感病症状

在广西部分栽培园区观察到疑似溃疡病、灰霉病和病毒病的症状，如图1所示，感病症状与钟彩虹等[13]、吴水美等[14]及王然等[15]描述症状基本一致.疑似溃疡病感病症状：叶片表面出现不规则形褐色斑点，病斑周围伴有3～5 mm明显的黄色晕圈.疑似灰霉病感病症状：被侵染的叶片从叶边缘开始发病，病部可见大量灰白色菌丝凸起，密生灰色孢子.疑似病毒病感病症状：叶片上出现褪绿斑驳、褪绿环纹、脉黄和花叶等症状.

a.疑似溃疡病症状；B.疑似灰霉病症状；C.疑似病毒病症状.

2.2 细菌性病菌的鉴定结果

鉴定到的细菌菌株及对应的已报道病害见表2.河池市南丹县园区6﹑9的样本携带溃疡病菌；乐业县园区13的样本携带溃疡病菌.

表2 采样点分离鉴定的细菌菌株及对应已报道病害

2.3 真菌性病菌的鉴定结果及预测病害

鉴定到的真菌菌株及对应的已报道病害见表3.桂林市龙胜县园区4的样本检出果实软腐病及灰霉病菌；河池市南丹县园区7、8、9的样本检出猕猴桃黑/褐斑病菌、果实软腐病及灰霉病菌；乐业县园区10﹑11的样本检出猕猴桃炭疽病、果实软腐病及灰霉病菌.

2.4 猕猴桃叶片的病毒检测结果

将有明显病毒病症状的猕猴桃叶片送检，检测结果如表4.龙胜县园区3、4分别携带2、4种病毒；南丹县园区8检出3种病毒.

表4 采样点春季样本病毒病检测结果列表

2.5 菌株致病力验证

将溃疡病、灰霉病及褐斑病菌分别接种在叶片上，灰霉病、黑斑病、软腐病及炭疽病菌接种于果实上.致病力实验结果表明，接种叶片14 d及果实6 d左右发病，菌株接种后均出现典型感病特征，随后在发病处重新分离到了接种的菌株，符合柯赫氏法则致病性检测.

(A,B)拟茎点霉菌(Phomopsis sp.)、(C,D)稻黑孢菌(N.oryzae)及灰霉菌病(E,F)(B.cinerea)分别接种在猕猴桃果实及叶片上感病症状.

3 结论与讨论

本团队于2021年春季对广西桂林市资源县和龙胜县、河池市南丹县及百色市乐业县等猕猴桃主产县的代表性园区进行病害调查，基于生物学特性及分子鉴定确定各园区的病原菌种类，预测了各园区将来可能发生的病害(表1～4)，为各园区进行有效防治奠定了理论基础.病原鉴定结果表明河池市南丹县芒场镇(园区6)及城关镇(园区9)、百色市乐业县甘田镇(园区13)感染了溃疡病，该病一旦感染，病菌繁殖及传播迅速，目前并无彻底根治方法，只能采取搭建避雨棚、加强园区管理等农业措施，结合化学及生物防治等方式进行控制.桂林市龙胜县龙脊镇(园区4)、河池市南丹县城关镇(园区8)、百色市乐业县同乐镇(园区11)感染了近年来产业中最严重的真菌病害——果实软腐病，该病主要在蕾期及幼果期感染，于贮藏期逐渐显现病症，需加强侵染期的防治.桂林市龙胜县龙脊镇(园区4)、河池市南丹县城关镇(园区8)、百色市乐业县同乐镇(园区10)感染了灰霉病；河池市罗城仫佬族自治县东门镇(园区7)、河池市南丹县城关镇(园区9)感染了黑/褐斑病；百色市乐业县同乐镇(园区11)感染了炭疽病；这些真菌病害的发生主要与园区修剪不当、郁蔽、湿度过大有关，需根据实际情况加强修剪、施用吡唑醚菌酯、嘧霉胺等真菌防治药剂.桂林市龙胜县江底乡(园区3)、桂林市龙胜县龙脊镇(园区4)及河池市南丹县城关镇(园区8)均感染2～4种病毒，可运用抗病威、病毒克星等药剂进行控制.

总体而言，广西春季病害主要为细菌性溃疡病、真菌性软腐病、黑/褐斑病、灰霉病、炭疽病及病毒病；按区域统计，南丹及乐业县的溃疡病发生率高，龙胜、南丹及乐业县的真菌病害发生率高，南丹及龙胜县的病毒病发生率高；其中南丹县的病菌种类及检出率最高.针对猕猴桃病害防治方面，还应引起更多重视，采取一些防治措施，如加强进行苗木带菌检测，建防护网，推广避雨栽培，防止病原菌传播；高垄栽培，及时清理沟渠的杂草，注意排水；注意夏季修剪及疏花疏果，保持果园通风透光，防止种植密度过大；减少药剂滥用；适当晚采收.同时可尝试发展新的红肉但抗性强的品种如‘楚红’及‘桂红’等.目前对广西猕猴桃的病害发生条件及病原菌侵染规律等了解还不够，后期需进一步进行周年病害鉴定及发生规律研究，形成适合当地的病害预测预报系统，建立广西猕猴桃病害数据资料库，开展药物筛选及防治效果对比研究，因地制宜地制定病害防治方案，为从整体上提高广西猕猴桃产业的水平提供理论基础.

(致谢：感谢华中农业大学植物科学技术学院洪霓教授团队协助完成病毒方面的工作.)