枸杞多糖调节肠道菌群及免疫功能研究进展*

王 莹，高 丽，金红宇，马双成 综述，昝 珂△，倪 健 审校

(1.中国食品药品检定研究院，北京 102629；2.中国农业大学动物医学院，北京 100193； 3.北京中医药大学，北京100029)

枸杞子作为我国传统的中药材和重要经济作物，同时作为药食同源产品，日常应用极为广泛。枸杞广泛分布于我国的宁夏、甘肃、青海、新疆、内蒙古、河北等地，其中宁夏被认为是枸杞的主要道地药材产区。2015年版《中华人民共和国药典》收载的枸杞品种为宁夏枸杞，这也是目前市场上的主流产品。枸杞中的化学成分较为复杂，包括多糖类、生物碱、类胡萝素、黄酮类、微量元素、氨基酸、维生素[1]等。其中枸杞多糖(LBP)作为枸杞中的主要成分，其药理活性研究已成为学者们关注的热点问题。已有研究表明，LBP具有多种生物活性，包括抗肿瘤[2]、免疫调节[3]、降血脂[4]、降血糖[5]、视网膜保护[6]和保肝[7]等功能。其中关于免疫调节作用研究更是热点问题，已有报道将LBP作为新型疫苗的免疫佐剂使用，被证明具有较好的功效[8]。多糖作为一种天然大分子化合物，其免疫调节作用研究一直是热点问题。尤其从20世纪90年代起，陆续开发了注射用香菇多糖、注射用黄芪多糖等产品，这些产品在临床上可用作肿瘤治疗辅助用药，调节机体免疫功能，有着高疗效、低毒性等特性。

机体一般通过免疫器官、免疫细胞及免疫活性物质发挥免疫调节功能。除了经典的免疫调节途径外，随着肠道菌群研究的不断深入，认为低生物利用度的药品可通过滞留肠道而发挥肠菌群调节作用，进而影响免疫功能[9]，这也为多糖免疫调节作用及机制研究提供了新的思路。本文对近年来有关LBP免疫调节功能及作用机制的报道进行梳理和总结，以期为LBP免疫调节机制的进一步研究和探索提供参考和思路。

1 对免疫器官的作用

机体免疫器官包括中枢免疫器官(胸腺、骨髓)和外周免疫器官(脾脏、淋巴结、咽扁桃体和肠集合淋巴结)，是免疫细胞定居及免疫应答发生的部位，研究表明LBP对于中枢和外周免疫器官均具有一定的调节作用。蒋艳等[10]研究发现，LBP可抑制肝癌Hca-F荷瘤小鼠体内实体瘤的生长，还可显著提高小鼠脾脏和胸腺指数。罗琼等[11]对枸杞粗多糖和高纯度LBP的免疫调节作用进行对比分析，结果发现，高纯度LBP能显著增加小鼠胸腺和脾脏指数，显示出更强的免疫调节功能。

李相玲[12]在环磷酰胺诱导的免疫抑制小鼠模型实验中发现，高剂量LBP可增加派氏结数目，且可提高肠道淋巴细胞比例，使其恢复到正常小鼠水平。派氏结是刺激分泌性免疫球蛋白A(sIgA)分泌的主要部位，可诱导细胞增殖分化以抵御肠道内有害物质侵袭，派氏结的大小、数量及淋巴细胞数量等均可作为反映肠道免疫的指标。

2 对免疫细胞的作用

免疫细胞是机体参与免疫应答或与免疫应答相关的细胞及其前体，在特异性免疫及非特异性免疫中有重要作用。免疫细胞主要包括巨噬细胞、树突细胞(DC)、自然杀伤细胞(NK)细胞及T、B淋巴细胞等。LBP能调节多种免疫细胞，且通过调节其生长和分化而产生机体免疫力增强效果。

2.1对巨噬细胞的影响 巨噬细胞是最早对病原微生物入侵进行应答的免疫细胞，是天然免疫应答的主要参与者，在免疫系统占据重要地位。被激活的巨噬细胞可释放多种细胞因子，如白细胞介素(IL)-1、肿瘤坏死因子(TNF)-α等，这些细胞因子是其发挥免疫调节功能的重要途径。

2.1.1对巨噬细胞增殖的影响 LBP可分别通过调节其存活率、吞噬活性及细胞因子释放等影响机体免疫力。杨青[13]在LBP对RAW264.7巨噬细胞调节作用的研究中发现，LBP能显著提高巨噬细胞的数量，重新调定极化状态，促进其向M1的状态转变。ZHANG等[3]从枸杞中分离得到高纯度多糖LBPF4-OL进行研究，发现其能明显刺激小鼠巨噬细胞增殖，进而提高机体免疫功能。

2.1.2对巨噬细胞吞噬活性的影响 巨噬细胞的吞噬活性反映了吞噬病原体的能力，是巨噬细胞活性的重要指标之一。黎雪如等[14]研究指出，LBP通过增加巨噬细胞表面C3b和Fc受体的数量和活力提高巨噬细胞的吞噬能力，其中C3b和Fc作为巨噬细胞表面受体，其数量和活性与巨噬细胞吞噬能力密切相关。

2.1.3对巨噬细胞细胞因子释放的影响 有研究指出，LBP可通过刺激巨噬细胞释放细胞因子，从而发挥其免疫作用[13]。许忠新等[15]采用MTT法检测巨噬细胞对肝癌细胞株Bel-7402生长的抑制作用，以评价LBP对健康人外周血中巨噬细胞功能的影响。该研究结果表明，LBP在50～100 μg/mL浓度下可显著提高巨噬细胞对肿瘤细胞的杀伤作用，同时刺激巨噬细胞分泌TNF-α等炎性细胞因子；张小锐[16]考察了从枸杞中分离所得的多糖LBPF4-OL对小鼠巨噬细胞的影响，结果发现，LBPF4-OL对巨噬细胞中TNF-α 、IL-1β、干扰素(IFN)-α和IFN-β mRNA的表达量有明显调节作用，并且进一步探索发现LBPF4-OL在巨噬细胞上的作用位点可能是Toll样受体 (TLR)4和TLR2。

此外，巨噬细胞可分泌一氧化氮(NO)，其作为具有生物活性的细胞信使因子在杀灭病原微生物等方面发挥作用。许金霞[17]研究发现，LBP可刺激诱导型一氧化氮合酶(iNOS)基因的表达，iNOS作为关键酶水平的其表达，增加可促进NO的生成，从而发挥免疫功能；同时该研究发现LBP对巨噬细胞的活化作用与激活TLR4受体有关。

2.2对淋巴细胞的影响 淋巴细胞根据其表型和功能可分为T淋巴细胞、B淋巴细胞，主要分布于外周免疫器官及血液中。LBP可通过影响淋巴细胞增殖能力、亚群数量和结构及抗体分泌等对机体免疫功能产生调节。

2.2.1对淋巴细胞增殖的影响 胡国俊等[18]研究表明，LBP对未经活化的淋巴细胞没有诱导增殖作用，然而对于分别经植物血凝素(PHA)和佛波酯(PMA)活化的T、B淋巴细胞增殖有显著的促进作用(P<0.05)。张小锐[16]在对LBP和LBP蛋白复合物免疫活性比较中发现，LBP和LBP蛋白复合物均对B淋巴细胞有明显促进增殖效果，且其在B淋巴细胞上的作用位点可能是CD19和TLR4受体。

2.2.2对T淋巴细胞亚群的影响 一般研究认为，成熟T细胞主要分为CD4+、CD8+细胞。细胞CD4+可分为Th1、Th2细胞,调节性T细胞(Treg)，Th17细胞和Tfh细胞，这些细胞可分泌细胞因子，从而达到调节细胞和体液免疫应答的效果；CD8+细胞具有免疫抑制和细胞毒性作用。这2种细胞的数量和比值常用来作为评价免疫功能的重要指标[19]。胡国俊等[18]考察了LBP对T淋巴细胞亚群的影响，结果表明LBP可提高脾脏中CD4+/CD8+比例，同时增加CD4+T细胞数量，表现为免疫正向调节功能。BO等[8]制备了LBP的脂质体，并考察了经其干预后正常小鼠体内T淋巴细胞亚群及细胞因子的变化，结果发现LBP脂质体可有效地刺激体内CD4+、CD8+T细胞的增殖，并提高CD4+T细胞与CD8+T细胞比例。

2.2.3对淋巴细胞分泌抗体的影响 抗体主要存在于血清等体液中，是B淋巴细胞受到抗原刺激后增殖分化为浆细胞后所产生的免疫球蛋白(Ig)，是介导机体免疫反应的重要分子。符古雅等[20]以接触氟化钠(NaF)的28名工人作为观察对象，考察LBP对机体免疫功能的影响。结果发现受试者在服用LBP后，血浆中IgG、IgA、IgM水平均明显提高，认为LBP可通过提高机体血清中的抗体水平，从而发挥机体免疫调节功能。BO等[8]在考察LBP脂质体对正常小鼠的免疫调节功能时也发现，经LBP作用后小鼠体内Ig水平明显提高。

2.3对其他免疫细胞的影响 DC是启动并调控细胞免疫应答的中心环节，是最强的抗原递呈细胞。研究发现，多糖可通过诱导DC的分化、增殖及成熟，从而加强DC的抗原呈递功能，发挥免疫调节作用。郝习等[21]研究发现，LBP不仅能增加DC的数量，还可促进小鼠DC的分化、成熟，提高DC细胞表面CD86和CD11a的表达，促进IL-12 的分泌，IL-12作为一种具有多种生物学活性的免疫调节因子，在刺激淋巴细胞增殖方面有重要作用。ZHU等[22]考察了LBP对DC的调节作用及作用机制，结果发现，LBP可与DC表面TLR2和(或)TLR4受体结合，进一步激活胞内核转录因子-κB(NF-κB)信号途径，从而诱导DC表型和功能成熟。此外，刘彦平等[23]采用环磷酰胺小鼠抑制模型考察了LBP的免疫调节功能，结果发现，LBP作用后小鼠体内白细胞数量显著增加，同时可改善环磷酰胺诱发的自然杀伤(NK)细胞活性降低状态。

2.4枸杞多糖对细胞受体及信号通路的影响 已有研究报道指出，植物多糖可通过特异性的结合细胞表面受体，激活有丝分裂原活化蛋白激酶(MAPK)、NF-κB等下游信号通路，从而促进TNF-α、NO、IL-6及IFN-γ等细胞因子的释放，最终达到免疫调控的目的。已被证实的植物多糖受体包括TLR-4、清道夫受体(SR)、甘露糖受体(MR)及补体受体3(CR3)[24]。

近年来，研究学者逐渐开展了LBP免疫调节信号通路的研究。CHEN等[25]在考察LBP蛋白复合物对T细胞调节作用的报道中发现，LBP可激活T细胞核因子(NFAT)，促进CD25的表达，同时诱导IFN-γ和IL-2基因转录和蛋白表达；XIAO等[26]考察了LBP对肝损伤模型的免疫调节功能，结果表明LBP免疫调节作用与TLR4/2受体相关，认为LBP与受体结合后可影响细胞内信号调控的蛋白激酶/细胞外信号调控的蛋白激酶(MEK/ERK)、核因子-κB(NF-κB)及c-Jun氨基末端激酶(JNK)/c-Jun等通路，从而发挥免疫调节作用；ZHANG等[2]考察了LBP对小鼠腹腔巨噬细胞的作用机制，该研究结果表明，LBP可显著上调巨噬细胞上TLR4/MD2的表达，增加p38 MAPKs的磷酸化，表明LBP是一种新的TLR，同时是MAPKs信号通路激活剂和诱导剂。

3 LBP基于对肠道菌群调节的免疫活性研究

人体肠道共居住着约3 500种微生物，其中有1 000余种细菌，包括需氧菌和厌氧菌(占总数的90%以上)。肠道菌群不仅参与人体的吸收代谢，还与结肠癌等肠道疾病、肥胖、2型糖尿病、自身免疫性疾病等紧密相关，故近年来肠道菌群的研究备受各国学者关注，已有研究指出肠道菌群对于机体免疫能力有重要的影响[27]。

近年来，研究人员逐步开展了有关植物多糖基于肠道菌群调节的免疫活性研究，并初步认为多糖免疫功能的发挥与其对肠道菌群的调节之间有密切关系，认为主要通过以下几方面发挥作用：(1)可保障肠道黏液层完整，发挥黏膜屏障作用。通常认为黏液层的存在及保证黏液层结构的完整可有效防止细菌移位，对发挥肠道免疫功能有重要作用。SUN等[28]研究发酵与未发酵的玉屏风多糖对断奶獭兔肠屏障的影响时发现，2种玉屏风多糖均能改善肠道菌群平衡，激发杯状细胞分泌黏蛋白，从而维持肠屏障完整性及维护肠道黏膜的功能。(2)可诱导产生sIgA。sIgA可与肠道内抗原及微生物结合，刺激机体产生体液免疫，是肠黏膜表面最重要的Ig[29]。有报道指出，无菌小鼠体内肠黏膜免疫力不足，肠系膜淋巴结也发育不良，且可分泌IgA的浆细胞数量也较少，但当无菌小鼠体内移植入普通小鼠的肠道菌群后，此种状态即发生逆转[30]。故认为肠道微生物可诱导IgA的产生，从而提高肠道免疫调节作用。(3)诱导T淋巴细胞的产生和分化：T细胞通过Th及Treg等细胞完成肠黏膜免疫屏障作用，是维持肠道免疫重要的免疫细胞。其中Th17可分泌多种细胞因子，如IL-17A、IL-17F和IL-22等，是肠道先天性免疫屏障的重要组成部分。而某些特殊菌群可刺激T细胞发挥免疫调节作用。已有研究证实，分节丝状菌可诱导肠道产生Th17细胞，从而促进机体的免疫反应[31]。脆弱型拟杆菌产生的多糖A 能诱导Treg细胞的分化，进而促进分泌IL-10，发挥抗炎症的作用[32]。此外，梭状芽孢杆菌Ⅳ簇和ⅪⅤa簇可诱导结肠上皮细胞中转化生长因子-β(TGF-β)的产生，同时刺激T细胞分化为Treg细胞[33]，与脆弱型拟杆菌具有相似的调控作用。

综上所述，肠道菌群可对机体肠道免疫系统发育、淋巴细胞反应等产生影响，而植物多糖通过调节肠道菌群的多样性和菌群结构发挥对机体免疫功能的调节作用。目前，已有少量研究人员初步考察了LBP对肠道菌群的调节作用，ZHU等[34]考察了LBP对小鼠肠道菌群的调节作用，研究结果发现，在属水平上，LBP可提高一些潜在的益生菌属的相对丰度，如阿克曼氏属、普雷沃菌和乳杆菌等；而在门水平上，LBP明显降低了拟杆菌门的相对丰度，提高厚壁菌的相对数量。DING等[35]以免疫抑制小鼠模型作为研究对象，考察了LBP对肠道微生物的影响，结果发现，LBP可显著增加类杆菌科和乳杆菌科的相对丰度，促进短链脂肪酸的产生，并初步探讨了LBP对肠道菌群调节与对机体免疫功能影响之间的相关性。程翔驯[36]以盐酸林可霉素灌胃获得肠道菌群失调的小鼠模型，并注射LBP以考察其效果。结果发现，与模型组相比，LBP干预后小鼠肠道中双歧杆菌、乳杆菌和肠杆菌的相对丰度显著提高；且同时发现LBP作用后小鼠肠道菌群的多样性明显优于模型组，认为LBP是理想的肠道微生态调节剂。

4 结语与展望

LBP是通过多个途径、多个层面、多个靶点对免疫系统发挥调剂作用的，可以改善免疫器官损伤，同时对T细胞、B细胞及巨噬细胞等主要免疫细胞产生影响，从而达到对机体免疫功能调节的目的。迄今为止，有研究初步阐述了LBP免疫活性及其作用途径，但仍有一些问题尚待解决。(1)LBP作为一种水溶性大分子，其胃肠吸收情况及LBP的生物利用度对阐述LBP免疫调节功能作用途径有重要意义。但目前关于LBP免疫活性的研究主要侧重于通过免疫器官或者外周血指标检测来反映其免疫调节功能，未结合LBP机体实际吸收利用情况，这既不利于整体阐述LBP的免疫作用途径，又很难通过此类研究给出一个合理的推荐使用剂量。(2)随着近年来肠道菌群研究的兴起，对于植物多糖免疫作用机制研究无疑是开辟了新思路。然而迄今为止，关于LBP肠道菌群的研究有限，且报道多限于单纯测定菌群结构或比例，而缺乏整体作用途径及相关通路的研究。(3)由于各实验室提取分离多糖的工艺步骤不同，导致得到LBP产物的结构、纯度均有很大差异，这种差异极可能导致免疫活性强弱及作用机制有所不同。同时由于缺乏多糖质量控制标准，导致实验的重复性无法考察，给后续相关药物开发带来困难[37]。故对LBP初级结构进行解析，针对工艺形成相对的质控方法，对于LBP免疫调节机制及构效关系研究都具有重要意义，且可以为LBP产品开发提供参考。

LBP作为一种有潜力的免疫调节剂，应进一步多角度、全方位地对其免疫调节作用进行探索，以期为LBP免疫机制的阐述、产品的开发及临床化提供理论参考。