石韦质量评价的研究进展

徐 硕，徐文峰，姜文清，金鹏飞

(北京医院药学部，国家老年医学中心，中国医学科学院老年医学研究院，药物临床风险与个体化应用评价北京市重点实验室，北京 100730)

石韦为水龙骨科植物庐山石韦Pyrrosiasheareri(Bak.) Ching、石韦Pyrrosialingua(Thunb.) Farwell或有柄石韦Pyrrosiapetiolosa(Christ) Ching的干燥叶，具有利尿通淋、清肺止咳和凉血止血的功效，主治热淋、血淋、石淋、小便不通、淋沥涩痛、肺热喘咳、吐血、衄血、尿血和崩漏[1]，收载于《中国药典》2015年版一部。同属不同种植物矩圆石韦P.martini(Christ) Ching在四川地区作石韦入药；西南石韦P.gralla(Gies.) Ching在云南地区作石韦入药；光石韦P.calvata(Bak.) Ching在广西地区作石韦入药[2]。石韦药材中的化学成分主要包括黄酮类、三萜类、酚酸类、甾体和挥发油等，药理研究表明，其具有抗菌、抗炎、降血糖、调节免疫系统和抗氧化等多种药理作用[3-8]，《中国药典》2015年版一部中以绿原酸作为石韦的指标成分，规定其含量不得少于0.20%[1]。本文对近年来石韦质量评价方面的研究结果进行综述，以期为更好地开发和利用该药材提供参考。

1 性状和显微鉴定

文瑞良等[9]对相异石韦的性状特征以及叶柄基部和根茎横切面、叶和根茎粉末的显微特征进行观察，研究结果可为其鉴别提供参考。穆二廷等[10]利用中药微性状鉴定法对石韦、庐山石韦和有柄石韦的干燥叶进行鉴别，结果显示，3种石韦在干燥叶的星状毛、斑点凹陷、体部细胞数和孢子囊群等方面具有明显区别，可用于3种石韦的鉴别。

2 指纹图谱研究

张莉莉等[2]利用粉末X射线衍射Fourier指纹图谱鉴定法对3个石韦对照品和 17个石韦药材样品进行计算分析，得到石韦的标准X射线衍射Fourier指纹图谱和特征标记峰值，结果表明，通过标准X射线衍射Fourier指纹图谱的几何拓扑图形与衍射特征标记峰值，能够实现对石韦、有柄石韦、庐山石韦、矩圆石韦、西南石韦和光石韦等不同品种石韦药材的鉴定。

张艺轩等[11]建立了石韦药材的HPLC指纹图谱。样品加入甲醇超声提取，采用 Diamonsil C18柱，流动相为乙腈-8 mL·L-1乙酸，梯度洗脱，检测波长为260 nm，对收集自各地区的44批石韦样品(包括15批石韦、15批有柄石韦、10批庐山石韦、3批光石韦、1批相似石韦)进行测定，建立了石韦与有柄石韦指纹图谱共有模式以及庐山石韦的共有模式，经与对照品比对，指认了其中4个特征色谱峰，分别为绿原酸、芒果苷、异芒果苷和圣草酚7-O-β-D-吡喃葡萄糖醛酸苷。通过相似度分析、聚类分析和主成分分析对其进行评价，结果表明，《中国药典》收载的石韦与有柄石韦指纹图谱相似，但与庐山石韦存在较大差异，相似石韦和光石韦与《中国药典》收载品种具有明显区别，该方法能为石韦药材的选购与品种鉴别提供参考。

黄艳等[12]利用高效液相色谱(HPLC)法建立了光石韦药材的指纹图谱。样品加入体积分数为70%的乙醇回流提取，采用SinoChrom ODS-BP柱，流动相为乙腈-2 mL·L-1磷酸，梯度洗脱，检测波长为205 nm。对产自广西不同地区的10批药材进行测定，结果显示，指纹图谱相似度为0.985～0.999，确定出12个共有峰，指认其中1个共有峰为芒果苷，10批药材12个共有指纹峰占总峰面积的90%以上，具有代表性。所建立的指纹图谱精密度、重复性、稳定性均良好，可作为光石韦药材质量的控制标准。高贝等[13]分别制备了有柄石韦的水、甲醇、体积分数为50%乙醇以及丙酮浸提物，通过HPLC法分析，结果显示，有柄石韦不同浸提物中的成分及相对含量存在很大差异。

中药的化学成分非常复杂，其红外谱图中的峰位、峰形和峰强表示体系中所含化学成分对应的特征吸收峰的特点，混合物组成的改变使整体光谱图会发生变化，由此构成了红外谱图的宏观指纹性[14]。李娜等[15]利用傅立叶变换红外光谱(FTIR)技术对石韦、庐山石韦和毡毛石韦不同浸提物中的化学成分进行分析，明确了其主要化学成分在不同浸出物中的分布。结果显示，3种石韦的甲醇提取物中化学成分相似，庐山石韦和石韦在3 300 cm-1处存在强吸收峰，且比毡毛石韦在此处的溶解度高，3种石韦均在1 200 cm-1处有强吸收峰，吸收强度依次下降。石油醚提取物中的吸收峰基本一致，庐山石韦和石韦的溶解度基本相同，但显著低于毡毛石韦。3种石韦的水提物均在3 400、3 350、1 666、1 050 cm-1处出现较强吸收峰。体积分数为30%的乙醇提取物中，均在3 330、1 600、1 440、1 050 cm-1处有较强吸收峰，毡毛石韦具有最高的吸收强度。通过比对不同石韦不同浸提物的红外光谱，对其主要化学成分差异进行了定性解析。

Cui L L等[16]通过建立石韦药材的HPLC指纹图谱并结合相似度评价、聚类分析和主成分分析，用于石韦属药材的鉴别和质量评价，并建立了石韦中多成分含量测定的一测多评法(QAMS)。指纹图谱共标定了20个共有峰，对42份石韦属药材进行分析，结果显示，样品可以被分为3类，其中大部分成分相似的样品主要集中在产地为山西、广西和四川等省。QAMS法是以绿原酸为参照物，建立与芒果苷、芦丁和山柰酚的相对校正因子，并计算其含量，同时采用外标法测定4个成分的含量，结果表明QAMS法可行。

3 含量测定研究

3.1有效部位的含量测定 杨鲁红等[17]对光石韦叶中总黄酮的超声波提取工艺进行优化，以芦丁为对照品，通过紫外可见分光光度法在510 nm波长处测定吸光度值A，以各影响因素设计正交实验，确定光石韦叶片中总黄酮超声提取的最佳工艺为：乙醇体积分数为50%，料液比为1∶40，超声时间为40 min，萃取温度为70 ℃，在此条件下总黄酮的平均提取率为16.16%。刘燕芳等[18]通过紫外可见分光光度法测定石韦药材中总黄酮的含量，样品加入体积分数为60%的乙醇超声提取，以芦丁为对照品，在510 nm波长处测定吸光度值A，结果显示，不同种类、不同产地和不同部位的石韦中总黄酮含量差异较明显。产地为安徽的石韦中总黄酮含量最高，其次为湖北的庐山石韦，有柄石韦中总黄酮含量相对较低，产地为四川成都的有柄石韦中总黄酮含量最低，小于10%。在同种石韦中，一般叶中总黄酮含量较高，叶柄和根茎中含量较低，但产地为湖北的庐山石韦以及产地为安徽的石韦根茎中总黄酮含量明显高于其他药用部位，表明石韦在药用时应考虑到不同药材中有效成分的含量，以期达到最佳药用效果。

多糖作为一类重要的生物活性成分，对其进行定量也很有必要[19]。李春磊等[20]采用紫外可见分光光度法对不同产地与不同部位有柄石韦的总多糖含量进行分析。样品经脱脂、碱水提取、除蛋白、沉淀等处理后得到总多糖，以葡萄糖为对照品，在490 nm波长处测定吸光度值A。结果显示，产地为山东胶东的有柄石韦叶中总多糖含量最高，为5.194%，其次是产地为山东济南、云南昆明、山东蒙山的样品，而市售石韦中总多糖含量最低。有柄石韦总多糖含量在叶中最高，其次是在全草中，在根茎中含量最低。高丽丽等[21]通过紫外可见分光光度法测定了不同品种石韦中的总多糖含量，结果显示，庐山石韦中总多糖含量最高，为3.526%，有柄石韦和石韦中总多糖含量次之，中越石韦、华北石韦和纸质石韦中总多糖含量差异不大，约为2%，西南石韦中总多糖含量最低，为1.382%。

3.2药材中单体成分的含量测定

3.2.1HPLC法 马辰等[22]通过HPLC法建立了石韦中绿原酸和圣草酚7-O-β-D-吡喃葡糖醛酸苷的含量测定方法。样品加入丙酮-水(7∶3)加热回流提取，采用Kromasil C18柱，以甲醇-水-磷酸(50∶200∶0.2)为流动相，检测波长为284 nm。结果显示，绿原酸和圣草酚7-O-β-D-吡喃葡糖醛酸苷的含量分别在0.01～5、0.004～5 μg范围内线性关系良好，平均回收率分别为97.9%、99.1%。对不同品种、不同产地的21批石韦样品进行测定，结果表明，含量差异较大，2批样品未检出圣草酚7-O-β-D-吡喃葡糖醛酸苷，其余样品中该成分含量为0.26～27.43 mg·g-1，测定样品中均含有绿原酸，含量为0.48～14.6 mg·g-1。

崔岚等[23]建立了测定石韦中绿原酸含量的HPLC法。样品加入体积分数为50%的甲醇超声提取，采用Hypersil BDS C18色谱柱，流动相为乙腈-0.5 mL·L-1磷酸溶液(11.5∶88.5)，检测波长为327 nm，结果显示，绿原酸质量浓度在4.42～53.04 μg·mL-1范围内与峰面积呈良好的线性关系，平均回收率为104.60%，测得4批药材中绿原酸含量在0.111 2～0.142 1 mg·g-1范围内。

张亚宁等[24]通过HPLC法测定石韦中木犀草素的含量。样品加入甲醇超声提取，采用Shimadzu C18柱，以甲醇-2 mL·L-1磷酸(50∶50)为流动相，检测波长为254 nm，结果显示，木犀草素的线性范围为0.032 5～0.390 0 μg，回收率为95.85%。

韦志疆[25]采用HPLC法建立了光石韦中芒果苷的含量测定方法。样品加入体积分数为50%的乙醇超声提取，采用Agilent TC-C18柱，流动相为乙腈-1 mL·L-1磷酸(13∶87)，检测波长为318 nm。结果显示，芒果苷在0～2.136 μg范围内线性关系良好，平均回收率为104.24%，测得10批光石韦中芒果苷的含量在46.02～88.53 mg·g-1范围内。

李文琪等[26]建立了测定光石韦中芒果苷含量的HPLC法，样品用体积分数为50%的乙醇提取，采用大连依力特C18柱，以乙腈-2 mL·L-1磷酸(13∶87)为流动相，检测波长为318 nm，结果显示，芒果苷在0.060 5～0.363 2 μg范围内线性关系良好，平均回收率为101.3%，测得产自广西不同地区的16批光石韦样品中芒果苷的含量在2.58%～7.32%范围内。

黄海婷等[27]采用HPLC法测定石韦药材中绿原酸的含量。样品加入体积分数为50%的甲醇超声提取，采用C18柱，流动相为乙腈-0.5 mL·L-1磷酸(11.5∶88.5)，检测波长为326 nm，结果绿原酸在0.036 8～0.809 6 μg范围内线性关系良好，平均回收率为100.08%，广西不同产地石韦药材中绿原酸的含量差异较大，以采自金秀县罗香乡的石韦药材中绿原酸含量最高，为3.696 7 mg·g-1；其次是采自资源县宝鼎瀑布景区和资源县龙洞峡景区的石韦，绿原酸含量分别为3.467 8、3.167 6 mg·g-1；产地为靖西县的柔软石韦中绿原酸含量最低，为1.132 6 mg·g-1。

高贝等[13]建立了测定有柄石韦及华北石韦中绿原酸和木犀草素含量的方法，样品加入体积分数为50%的甲醇超声提取，采用Shim-pack VP-ODS柱，流动相为乙腈-5 mL·L-1磷酸(9∶91)，检测波长为326 nm，结果显示，2种石韦中绿原酸的含量分别为1.51%、0.76%，木犀草素的含量分别为0.021%、0.047%。

龙毅等[28]建立了能同时测定石韦中谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸和亮氨酸含量的HPLC法。采用Welchrom C18柱，流动相A为0.1 mol·L-1醋酸钠缓冲液(以醋酸钠调节pH值至6.5)-乙腈(93∶7)，流动相B为乙腈-水(4∶1)，梯度洗脱，检测波长为254 nm。结果显示，4种氨基酸的质量浓度分别在4.92～49.2、3.168～31.68、2.6～26、2.88～28.8 μg·mL-1范围内线性关系良好，平均回收率在98.3%～100.1%范围内，测得石韦中4种氨基酸的含量分别为1.189、0.700、0.360、0.343 mg·g-1。

邵尉等[29]建立了能同时测定有柄石韦中原儿茶酸、绿原酸、香草酸、咖啡酸、芒果苷和芦丁6个成分含量的HPLC法。药材经石油醚脱脂处理后，用体积分数为70%的甲醇超声提取，采用SinoChrom ODS-BP C18柱，以乙腈-1 mL·L-1磷酸为流动相，梯度洗脱，检测波长为320 nm。结果显示，6个成分线性关系良好，平均加样回收率在97.32%～102.16%范围内，测得3批不同产地药材中6个成分的含量分别在0.862～1.916、3.364～9.055、0.847～2.929、0.183～0.688、0.192～0.769、0.467～1.593 μg·mg-1范围内。

徐红等[30]通过HPLC技术建立了测定黔产庐山石韦中绿原酸和芒果苷含量的方法。样品用体积分数为50%的甲醇超声提取，采用Phenomenex C18柱，以乙腈-5 mL·L-1磷酸为流动相，梯度洗脱，检测波长为320 nm，结果显示，绿原酸和芒果苷分别在0.097 9～0.951 5、0.097 6～0.979 6 μg范围内线性关系良好，平均回收率分别为98.33%、98.89%。分布于凯里市的庐山石韦中绿原酸含量较高，而芒果苷含量较低，分布于遵义道真的庐山石韦中芒果苷含量较高，而绿原酸含量较低。

3.2.2超快速液相色谱(UFLC)法 任彪等[31]建立了能同时测定有柄石韦中新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、1-咖啡酰奎宁酸、3，5-二咖啡酰奎宁酸、4，5-二咖啡酰奎宁酸、3，4-二咖啡酰奎宁酸、紫云英苷、圣草酚-7-O-β-D-吡喃葡萄糖醛酸苷和山柰酚-3,7-双-O-葡萄糖苷10个成分含量的UFLC法。采用Kromasil 100-2.5 C18柱，以1 mL·L-1甲酸-1 mL·L-1甲酸甲醇溶液为流动相，梯度洗脱，检测波长为326 nm。结果显示，10个成分在各自质量浓度范围内线性关系良好，平均回收率在99.1%～104.5%范围内。

3.3微量元素的含量测定 季晓辉[32]应用火焰原子吸收光谱法测定了汉中石韦中铁(Fe)、铜(Cu)、锌(Zn)和锰(Mn)4种微量元素的含量。药材样品加入浓硝酸消解，结果显示，4种元素在0～5 μg·mg-1范围内线性关系良好，平均回收率在93.5%～106.2%范围内，测得汉中石韦中4种元素的含量分别为12.91、32.12、22.45、72.84 μg·g-1。

4 药材中的挥发性成分研究

康文艺等[33]通过顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用(HS-SPME-GC-MS)技术对石韦叶的挥发性成分进行分析，采用HP-5MS石英弹性毛细管柱，载气为高纯氦气，进样口温度为250 ℃，程序升温，不分流进样，电离方式为电子轰击电离源(EI)，电离能量为70 eV，离子源温度为250 ℃。结果显示，从石韦叶挥发性成分中鉴定了40个化合物，占叶挥发性成分总量的90.03%，其中正壬醛(11.82%)、1-辛烯-3-醇(4.88%)和甲酸辛酯(1.92%)是石韦叶中主要的香气成分，可作为食用香料、香精来源。

康文艺等[34]利用HS-SPME-GC-MS技术结合保留指数法，分析绒毛石韦和石韦根中的挥发性成分。从石韦根的挥发性成分中鉴定了33个化合物，占根挥发性成分总量的92.15%，1-己醇(21.28%)、己醛(11.71%)、邻苯二甲酸二乙酯(7.61%)、正壬醛(5.99%)、甲氧基-苯基-肟(5.53%)、十六酸(5.32%)和(Z，Z)-9，12-十八碳二烯酸(3.07%)为石韦根中的主要挥发性成分。从绒毛石韦根挥发性成分中鉴定了36个化合物，占挥发性成分总量的95.01%，己醛(44.63%)、1-己醇(8.63%)以及二环[2.2.1]庚烷-3-亚甲基-2，2-二甲基-5-醇-乙酸酯(7.05%)是绒毛石韦根中的主要挥发性成分。

5 结语

石韦质量评价的研究内容主要包括性状和显微鉴定、指纹图谱、含量测定以及药材中的挥发性成分分析，均取得了一定进展，但也存在一些问题。在指纹图谱研究方面，仅鉴定了少部分共有峰，需要加强通过利用液相色谱-质谱联用技术总结已有对照品的质谱裂解规律，在此基础上对更多的同类化合物进行结构鉴定。在含量测定研究方面，大部分是对其中的黄酮和酚酸类成分进行定量分析，而对于其他类型活性成分如三萜类化合物的含量测定研究极为有限。对于无机元素的定量分析，仅对药材中Fe、Cu、Zn和Mn 4种元素进行测定，可以尝试测定更多种无机元素的含量，并建立无机元素指纹图谱，从而能够更加全面地控制石韦药材的质量。《中国药典》2015年版一部收载的石韦为水龙骨科植物庐山石韦、石韦或有柄石韦的干燥叶，作为多基源药材，有必要通过指纹图谱和定量分析对这3种石韦进行化学成分、有效成分含量的一致性研究，找出其异同点，从而更好地指导该药材的临床应用。