炉甘石依沙吖啶洗剂含量测定方法的改进与长期稳定性考察

吴 洋，程 钢

(安徽医科大学第一附属医院药剂科，合肥 230022)

炉甘石依沙吖啶洗剂是皮肤科的常用制剂，在国内医疗机构应用广泛[1-3]，成分包括炉甘石、氧化锌、乳酸依沙吖啶和甘油等，用于治疗丘疹、湿疹、荨麻疹等皮肤炎症，疗效确切；医院皮肤科医生也经常将该制剂作为个体化给药的基质溶液，可添加氯霉素、地塞米松等水针剂，治疗其他皮肤疾患，使其适用范围进一步拓展。乳酸依沙吖啶是该制剂的主要成分之一，含量为1 g·L-1，质量标准收载于《安徽省医院制剂规范》1999年版[4]，含量测定方法采用紫外分光光度法(UV法)，本实验在参考文献方法[1,5-8]的基础上，建立了高效液相色谱(HPLC)法测定炉甘石依沙吖啶洗剂中乳酸依沙吖啶的含量，并在此基础上对制剂进行12个月的稳定性考察，为制剂有效期的确定提供参考。

1 仪器与试药

1.1仪器 Agilent1200型高效液相色谱仪：包括G1310A四元泵、G1314B VWD检测器、G1379B真空脱气机、7725i手动进样器、Agilent 1200化学工作站(美国Agilent公司)；FA 2004万分之一电子天平(上海天平仪器厂)；B3200S-T型超声清洗器(必能信超声有限公司)；pHS-3C型酸度计(上海雷磁仪器厂)；DH64型电热恒温干燥箱(上海医疗器械七厂)。

1.2试药 乳酸依沙吖啶对照品(中国食品药品检定研究院，批号100290-201002，质量分数为94.3%)；甲醇(色谱纯，美国Tedia公司)；灭菌注射用水(湖南科伦制药有限公司)；炉甘石依沙吖啶洗剂(本院制剂室自制，批准文号：皖药制字H20070013，批号：20181113、20181212、20190123)；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1HPLC法测定乳酸依沙吖啶的含量

2.1.1色谱条件 色谱柱：Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：0.5 g·L-1十二烷基磺酸钠溶液-甲醇(30∶70)(磷酸调节pH值为 3.30)；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：269 nm；柱温：30 ℃，进样量：20 μL。理论塔板数以乳酸依沙吖啶峰计算不小于3 000。

2.1.2溶液的制备 对照品溶液：精密称取乳酸依沙吖啶对照品8.75 mg，置于100 mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，得对照品储备液。精密吸取对照品储备液2 mL，置于50 mL量瓶中，用流动相稀释到刻度，摇匀，即得质量浓度为3.30 mg·L-1的对照品溶液。

供试品溶液：精密吸取炉甘石依沙吖啶洗剂2 mL，置于25 mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，再精密吸取上述溶液2 mL，置于50 mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，静置10 min，吸取上清液，用0.45 μm有机系滤头过滤，弃去初滤液，即得。

阴性对照溶液：按照处方配制不含乳酸依沙吖啶的空白炉甘石洗剂，按照上述供试品溶液的制备方法操作，即得。

2.1.3专属性和系统适用性实验 分别取2.1.2项下制备的对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各20 μL，按照2.1.1项下色谱条件分析，记录色谱图，见图1。由图1可知，乳酸依沙吖啶峰形良好，保留时间约为11.5 min，样品中其他成分和辅料对乳酸依沙吖啶测定无干扰，理论塔板数按照乳酸依沙吖啶峰计算不小于3 000。

图1 HPLC图A.对照品溶液；B.供试品溶液；C.阴性对照溶液；1.乳酸依沙吖啶。Fig.1 HPLC chromatogramsA.reference soloution；B.sample solution；C.negative control solution;1.ethacridine lactate.

2.1.4线性关系考察 分别精密量取2.1.2项下制备的对照品储备液1、2、3、4、5、6 mL，置于100 mL量瓶中，以流动相稀释至刻度，得质量浓度分别为0.83、1.65、2.48、3.30、4.12、4.95 mg·L-1的系列对照品溶液，按照2.1.1项下色谱条件依次进样20 μL，测定峰面积。以峰面积(y)为纵坐标、质量浓度(x)为横坐标，绘制标准曲线，回归方程为y=186.95x-0.212 6(r=0.999 9)，线性范围为0.83～4.95 mg·L-1。

2.1.5精密度实验 日内精密度:分别取2.1.4项下制备的低、中、高质量浓度(1.65、3.30、4.95 mg·L-1)的对照品溶液各20 μL，按照2.1.1项下色谱条件各重复进样3次，进样间隔时间为4 h，记录峰面积，计算低、中、高质量浓度的乳酸依沙吖啶的日内精密度RSD值，分别为0.85%、0.30%、0.53%(n=3)。

日间精密度：取2.1.4项下制备的低、中、高质量浓度(1.65、3.30、4.95 mg·L-1)的对照品溶液各20 μL，每日进样1次，连续测定3 d，记录峰面积，计算低、中、高质量浓度的乳酸依沙吖啶的日间精密度RSD值，分别为1.52%、1.30%、1.63%(n=3)。

2.1.6稳定性实验 取2.1.2项下制备的供试品溶液，在制备后0、2、4、6、8、12 h各测定1次峰面积，结果RSD值为0.75%(n=6)，表明供试品溶液在制备后12 h内稳定性良好。

2.1.7重复性实验 取批号为20181113的炉甘石依沙吖啶洗剂，按照2.1.2项下方法制备供试品溶液6份，分别进样分析，计算乳酸依沙吖啶含量的RSD值为1.53%(n=6)，表明该方法重复性良好。

2.1.8回收率实验 按照处方配制不含乳酸依沙吖啶的空白炉甘石洗剂6份，每份10 mL，分别加入乳酸依沙吖啶对照品10.0 mg，摇匀，制得模拟洗剂样品，按照2.1.2项下方法制备供试品溶液，进样测定峰面积，代入标准曲线求得乳酸依沙吖啶含量，计算回收率，结果见表1。

表1 回收率实验结果 (n=6)Tab.1 Results of recovery test (n=6)

2.1.9样品含量测定 取炉甘石依沙吖啶洗剂样品3批，按照2.1.2项下供试品溶液制备方法制备供试品溶液，按照2.1.1项下色谱条件进样，测定峰面积，按外标法计算乳酸依沙吖啶含量，结果显示，3批炉甘石依沙吖啶洗剂中乳酸依沙吖啶的含量分别为0.991、0.980、0.971 g·L-1，3批样品含量的RSD值分别为0.76%、0.96%、1.53%(n=3)，符合质量标准中乳酸依沙吖啶的含量限度要求(标示量的90.0%～110.0%)。

3 炉甘石依沙吖啶洗剂的长期稳定性考察

3.1考察方法与项目 根据《中国药典》2015年版四部9001条规定，取制剂3批，市售包装，在室温(25±2) ℃、相对湿度为60%±10%的条件下避光放置12个月，分别于生产后第0、3、6、9、12个月末取样，按稳定性重点考察项目进行检测，根据混悬型洗剂的特点，其重点考察项目确定为性状、含量、再分散性和沉降体积比[9]。

3.2性状考察 炉甘石依沙吖啶洗剂的初始性状为粉红色带微黄色混悬液，3批留样制剂分别于生产后第0、3、6、9、12个月末与同批号原料新鲜配制的炉甘石依沙吖啶洗剂合格品进行外观比色，并观察是否产生棕色沉淀，结果见表2。

3.3含量考察 依据制剂质量标准[4]，本制剂含锌化合物以氧化锌(ZnO)计不得少于140 g·L-1；含乳酸依沙吖啶(C15H15N3O·C3H6O3)应为标示量(1 g·L-1)的90.0%～110.0%。按照新建立的HPLC法测定3批留样制剂第0、3、6、9、12个月末的乳酸依沙吖啶含量；同时根据原质量标准测定留样制剂中的氧化锌含量，结果见表2。

3.4再分散性考察 将3批留样制剂分别取10 mL，置于10 mL具塞量筒中，密封筒口，静置24 h使其沉降，然后将具塞量筒倒置翻转(一正一反为1次)，记录沉降物分散完全所需的翻转次数[3,10]。于第0、3、6、9、12个月末分别取样测定，结果见表2。

表2 长期稳定性考察结果(25 ℃，避光)Tab.2 Results of long-term stability study (25 ℃，protected from light)

3.5沉降体积比(F值)测定 将3批留样制剂分别取10 mL，置于10 mL具塞量筒中，密封筒口，同时振摇1 min，记录沉降前原始高度H0，计时，于10、30 min及1、2、3、6、24、48 h测定沉降物高度H，计算F值,F=H÷H0[3,10]。于第0、3、6、9、12个月末分别取样测定，结果见表3。

表3 3批留样制剂的沉降体积比(F值)考察结果Tab.3 Results of the sedimentation rate (F value) in 3 samples

4 讨论

4.1含量测定方法改进的必要性 炉甘石依沙吖啶洗剂是医院传统制剂，在皮肤科用药中有着不可替代的作用。原质量标准中采用UV法测定乳酸依沙吖啶含量，在长期实践中发现，该方法测定结果偏低，容易对样品含量造成误判。究其原因，是因为该制剂中含炉甘石和氧化锌固体颗粒，在过滤时容易对乳酸依沙吖啶产生吸附，虽然用0.05 mol·L-1硫酸溶液冲洗滤纸，但不能完全溶解固体颗粒，导致滤液中乳酸依沙吖啶的含量偏低。冬季因气温低，固体颗粒溶解度差，吸附更多，测定结果经常达不到含量低限，同时也使长期稳定性考察无法顺利进行。笔者曾参考文献实验改良后的UV法[11]，即先用高浓度硫酸溶液(1 mol·L-1)溶解样品，再用水稀释定容后过滤，方法回收率有所提高，但仍无法解决冬季含量偏低的问题，由此可见，改进其含量测定方法是十分必要的。

4.2HPLC色谱条件的优化及方法的优点 有关HPLC法测定乳酸依沙吖啶原料及其制剂的含量已有较多文献报道[1,7-10]，笔者以甲醇-乙腈-水(60∶37∶3)以及含1 g·L-1庚烷磺酸钠的磷酸盐缓冲液∶乙腈(70∶30)为流动相[1]，并试用Agilent Eclipse XDB-C18和Diamonsil C182种色谱柱，均产生较严重的拖尾现象，因乳酸依沙吖啶具有2个芳香胺基结构，C18对其有强保留，甲醇-水系统和乙腈-水系统均较难洗脱[5]，采用0.5 g·L-1十二烷基磺酸钠溶液-甲醇(30∶70)(磷酸调节pH值为3.30)流动相较易洗脱，峰形良好。本研究中样品前处理采用2步稀释，较好地解决了固体颗粒的吸附问题，虽然未用硫酸液溶解炉甘石和氧化锌颗粒，但第2步稀释后样品浓度已降低300倍以上，静置后取上清液过滤，固体颗粒对乳酸依沙吖啶的吸附可忽略不计。该方法专属性强，准确度高，可较好地控制制剂质量。

4.3长期稳定性考察结果分析 炉甘石依沙吖啶洗剂在临床使用已超过30年，生产工艺成熟，安全性、有效性均有保障，制剂中乳酸依沙吖啶易见光分解使混悬液变色甚至产生沉淀，故成品采用聚乙烯瓶加纸盒避光包装，在稳定性考察中未再进行加速实验和影响因素实验(如光照等)。由表3和表4可知，在12个月内，3批样品的性状、含量、沉降体积比变化不大，每个考察时间点48 h内沉降速率基本一致，说明混悬液稳定性未发生改变；重新翻转次数在3、6、9、12个月末与考察初期基本一致，说明混悬液未形成不易分散的结块，再分散性较好。含量测定结果表明，3批留样制剂12个月内含量变化很小(<1.0%)，说明室温条件下药物稳定，根据《中国药典》2015年版规定，未做95%可信限统计分析[9]。综上所述，炉甘石依沙吖啶洗剂在12个月内稳定性好，药品说明书中标注的1年有效期切实可行。

4.4炉甘石原料的现状及对制剂质量和稳定性的影响 炉甘石属矿物类中药材，《中国药典》2015年版一部规定其基源为碳酸盐类矿物方解石菱锌矿，主含碳酸锌[12]，临床应用需经煅制、水飞炮制后方可使用，但矿物药作为不可再生资源，随着不断开采，我国的少数几个菱锌矿已日渐枯竭，而市场用量在不断增大，供需矛盾使炉甘石市场伪品率日渐增高，近年来已达60%以上[13]。为保护自然资源，同时保证炉甘石的可持续供应，国内多年来一直在开展人工合成炉甘石的研究和实践。研究表明，炉甘石的药理作用与其成分与粒度相关，颗粒越小，抑菌性和收敛性越强[14-15]，炉甘石所含成分中抑菌活性强弱为Zn5(CO3)2(OH)6>ZnO>ZnCO3，生品含Zn5(CO3)2(OH)6较多，炮制品因经过煅烧，Zn5(CO3)2(OH)6等分解成ZnO，但因粒径变小，抑菌效果强于生品[16]。化学合成炉甘石粉是通过硫酸锌和碳酸氢铵或碳酸钠合成Zn5(CO3)2(OH)6，干燥后再添加少量氧化铁着色而成[17]，其特点是既保持了与生品相同的主成分和抗菌活性，又保持了与炮制品相似的较小粒度，还避免了天然药物中铅、镉等毒性元素的危害。随着合成工艺的提高，炉甘石粉的质量不断提升，化学合成品在国内炉甘石原料药市场占比越来越高。

国内生产炉甘石粉有3个厂家，分别为上海某厂、湖南某厂和南昌某厂，我单位在配制制剂时均有应用。3个厂家产品的颜色、性状和粒度各不相同，湖南厂家颜色浅、粒度细，南昌厂家颜色深、粒度大，上海厂家居中。在临床应用和稳定性考察中获知，南昌厂家原料因颗粒较粗，配制的制剂用于皮肤时砂砾感较强，患者不易接受；湖南厂家原料最细腻，配制的制剂基本无皮肤刺激感，在稳定性考察中，F值较大，初配成的混悬液稳定性好，但由于粉末太细，一旦与氧化锌聚合则不易分离，在长期贮存时，容易产生黏壁和瓶底板结现象，再分散性不好。因此，本研究选用上海厂家的原料进行了长期稳定性实验，这也是在不改变处方前提下的相对最佳结果。也有文献报道，炉甘石洗剂中加入卡波姆、羟丙甲基纤维素、壳聚糖等新型无毒助悬剂，可较好地改变混悬剂的稳定性[18-20]，改善黏壁和板结现象，这也是今后改良处方、提高制剂质量、进一步满足患者需求的研究方向。