ABPPk 对施万细胞血清剥夺损伤的保护作用机制研究*

仲晶飞，周家名，杨晋娴，李枚原

（1 南通大学杏林学院医学部，2 南通大学江苏省神经再生重点实验室，南通 226001）

随着现代社会的发展，全世界周围神经损伤的发病率逐年升高，周围神经损伤能引起患者部分或全部运动功能的丧失。由于周围神经再生能力差，致残率高，给患者带来沉重的经济和社会负担。干性坐骨神经痛作为一种常见的并发症，通常是由创伤、挤压、缺血、肿瘤等损伤刺激诱使坐骨神经发生病变所引起的。作为周围神经中非常重要的胶质细胞，施万细胞（Schwann cells，SCs）包裹有髓神经纤维和无髓神经纤维，可以分泌大量的神经营养因子促进周围神经轴突生长和髓鞘化[1]。一旦SCs 发生损伤，可以诱导细胞凋亡并限制周围神经功能恢复和再生[2]。因此，抑制SCs 凋亡将有助于提高周围神经的再生及功能恢复。

牛膝多肽（Achyranthes bidentata polypeptides，ABPP）是从中药牛膝中提取的活性物质，通过高效液相色谱（high-performance liquid chromatography，HPLC）技术进一步提纯，得到了生物活性更强的ABPPk[3]。ABPPk 可以有效保护因大脑缺血引起的原代皮质神经元凋亡，且可通过抑制多巴胺能神经元凋亡来拮抗帕金森病[4]。目前ABPPk 对SCs 凋亡的保护作用已日趋深入和完善[5]，但其内在分子机制仍有许多未知之处。本研究使用SCs 血清剥夺（serum deprivation，SD）模型，结合前期ABPPk 对SCs SD 损伤的保护作用，通过转录组测序技术深入研究其作用机制，进而探讨ABPPk 对干性坐骨神经痛及其他周围神经病变的临床意义。

1 材料和方法

1.1 SCs 培养 取新生Sprague-Dawley 大鼠，75%乙醇灭菌消毒，取双侧坐骨神经，胶原酶/胰酶混合消化完全后离心弃上清液，加入含有10%胎牛血清的达尔伯克改良伊格尔培养基（Dulbecco′s modified Eagle′s medium，DMEM）完全培养基重悬细胞并过筛网，进行细胞计数。均匀种于多聚赖氨酸包被好的培养皿中，置于含5%CO2的37 ℃细胞培养箱中培养。培养过夜，避光条件下换成含有阿糖胞苷（10 μmol/L）的完全培养基。继续培养2 d 后，换成含有Forskolin（2 μmol/mL）和HRG（10 ng/mL）的完全培养基继续培养，每3 d 换液，直到细胞融合。待细胞铺满培养皿底部后，胰酶消化，离心得到细胞沉淀，加入适量含有Thy 1.1（1∶1 000）的完全培养基重悬细胞，并于冰上孵育2 h。离心，弃上清，加入含有补体的DMEM，轻轻吹打混匀后于37 ℃孵育30 min。离心后完全培养基清洗2 次，均匀种于培养皿中，置于37 ℃细胞培养箱中继续培养。培养过夜，换成含有Forskolin（2 μmol/mL）和HRG（10 ng/mL）的完全培养基继续培养。

1.2 SCs SD 处理及分组 SCs 按照5×105/mL 密度种于6 孔板，过夜后用磷酸缓冲盐溶液（phosphatebuffered saline，PBS）清洗2 次，分为4 组：正常对照组（Con 组）、SD 处理组（SD 组）、ABPPk处理组（ABPPk组）、神经生长因子（nerve growth factor，NGF）处理组（NGF 组）。其中Con 组加入完全培养基正常培养，其余3 组更换为无血清培养基，37 ℃孵育4 h。然后，3组均弃无血清培养基，分别更换为完全培养基、含有ABPPk（0.5 μg/mL）的完全培养基、含NGF（0.1 μg/mL）的完全培养基继续培养24 h。

1.3 转录组测序 使用Trizol（Life technologies）提取不同处理组SCs RNA，使用RNeasy 吸附柱（Qiagen）去除可能含有的DNA，得到高质量RNA 样品。以mRNA 短片段为模板合成cDNA，进行PCR 扩增，构建好的RNA 文库用Agilent 2100 Bioanalyzer 质检合格后，使用Illumina 测序仪进行测序。得到的测序数据进行后续生物信息学分析。

1.4 生物信息学分析 进行维恩图（Veen Diagram）分析及聚类热图分析，运用差异表达基因的表达值进行聚类分析，通过基因本体（gene ontology，GO）分析进行基因分类和富集计算，进一步对相关基因进行蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络分析。

1.5 统计学方法 采用SPSS 22.0 软件进行统计学处理，计量资料数据均以表示，组间比较采用方差分析（ANOVA），以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SD处理后不同分组的维恩图分析 对SD 组、ABPPk 组、NGF 组的主要差异基因进行维恩图分析，通过重叠交集发现共同表达以及特异表达的基因。分别有80 个、154 个和85 个基因在ABPPk 组、NGF 组及SD 组中特异性表达。其中，在ABPPk 组、NGF 组及SD 组中均表达的有12 个基因，在ABPPk组与NGF 组中均表达的有30 个基因（图1，见封二）。

2.2 聚类热图分析 对不同处理的4 组SCs 的差异基因进行聚类热图分析，结果显示ABPPk 组和NGF 组中均有部分基因特异性表达。ABPPk 组中聚类热图上方区域有一部分基因特异性高表达，这部分基因在Con 组、SD 组中主要显示负调控，而在NGF 组中也只有少部分显示正调控。NGF 组中聚类热图下方区域也有一部分基因特异性高表达，这部分基因在Con 组、SD 组和ABPPk 组中也主要显示为负调控（图2，见封二）。

2.3 GO 富集分析及PPI 网络分析 通过聚类热图分析发现，ABPPk 组上方区域有部分特异性高表达的基因；GO 富集分析结果显示这些基因主要参与正向调节粒细胞分化、Rho 蛋白信号转导、肌动蛋白细胞骨架、细胞增殖、蛋白质泛素化等生物学过程，其中的分子主要参与Rac GTPase 结合、锌离子结合、ATP结合、酶结合等相关功能；PPI 网络分析显示Rhog、Pak2、Yes1、Sptan1、Dock7、Mylpf、Myo9b、Mef2c、Fgf5等分子参与其中并发挥关键作用（图3，见封二）。通过聚类热图分析发现，NGF 保护组下方区域有部分基因特异性高表达；GO 富集分析结果显示，这部分基因主要参与囊泡介导的运输、胞吞作用、细胞形态调节、钙离子稳态调节等生物学过程，其中的分子主要参与促进核糖体结合、蛋白质结合、DNA 结合、微管结合等功能；PPI 网络分析结果显示，Myl12b、Kalrn、Mapk6、Sgk1、Cdc42bpb、Cnot6、Bcl2l1、Cdkn2a、Myo5b等分子参与其中并发挥关键作用（图4，见封二）。

3 讨论

周围神经损伤的修复和功能重建仍然是医学领域的挑战性难题，也是神经科学领域的研究热点。缓慢的神经再生、残端变性、组织粘连、肌肉萎缩等因素会限制受损神经的功能恢复[6]。此外，周围神经损伤的修复和再生是一个非常复杂的生物学过程，在此过程中增殖的SCs 可以分泌多种神经营养因子促进轴突生长和髓鞘再生[7-8]。之前关于周围神经再生的研究[9]主要集中在构建组织工程移植物以及SCs中的分子调控机制和信号通路等方面。而周围神经再生的药物治疗是另一个研究重点。即使一些神经营养因子已被选择并用于外周神经损伤治疗，仍然存在许多不足，如疗效不佳、成本过高或缺乏特异性靶向作用[10]。因此，未来的研究应着眼于寻找范围广泛的具有自主知识产权的活性成分，将其开发为保护SCs 并促进轴突生长的新药。

本研究结果表明，ABPPk 和NGF 对SCs 缺血的保护作用机制有所不同，主要调控分子也不同。ABPPk 与NGF 对SCs 的分化、损伤保护与细胞功能的维持表现出一定的相似性，不同的是ABPPk 还主要参与细胞间信号传递、细胞增殖、蛋白质泛素化等生物学功能，并有Rhog、Pak2、Yes1、Mef2c、Dock7 等部分核心基因参与其中。而NGF 组中Kalrn、Mapk6、Sgk1、Cdc42bpb、Cnot6 等核心基因主要参与囊泡介导的运输、胞吞作用、细胞形态调节、钙离子稳态调节等生物学过程。Rhog 是Rac 亚家族的成员，已被发现对许多细胞类型中的肌动蛋白细胞骨架的调节至关重要。Rhog 还可以诱导多种细胞功能，包括神经突生长、细胞迁移和侵袭[11]。Pak2 是Pak 家族激酶的成员，在应激信号传导中发挥重要作用。Pak2 可以通过与小GTPase、Cdc42 和Rac1 结合或通过caspase 3 裂解激活。Cdc42 激活的Pak2 介导细胞停滞，而caspase 3 裂解激活的Pak2 主要参与细胞凋亡[12]。Nrg1 受体Erbb2 通过磷酸化Tyr-1118 直接结合并激活Dock7，Dock7 充当Erbb2 的细胞内底物以促进SCs 迁移。Dock7 还可以通过海马神经元中的Rac1 调节轴突和树突的极性形成，Dock7 介导的Rho GTPase 激活可能导致最终触发髓鞘形成的极性复合物的产生[13]。这些关键基因相互作用，共同参与调节ABPPk 对SCs SD 损伤的保护作用。

综上，与现有的神经营养因子NGF 相比，ABPPk研发的药物在急性期周围神经损伤患者的治疗中具有广阔的前景。本研究在原有传统经验的基础上，运用现代生物学先进的高通量技术，将传统中药与先进的生物学技术相结合，更加深入全面地研究ABPPk和NGF 对SCs 缺血损伤的保护作用。将有助于加深对ABPPk 的功能和机制的理解，促进新治疗靶点的发现，为周围神经损伤的临床治疗提供实验和理论基础。