SD大鼠放射性直肠炎模型的建立

袁慧,刘梦雅,刘欢,李建国

(中国辐射防护研究院，山西，030006)

放射治疗是宫颈癌、前列腺癌等盆腔恶性肿瘤治疗的常用手段，且近年来在此类肿瘤治疗中的地位日渐提高[1]。然而直肠与宫颈、膀胱等脏器的解剖位置相近，均在腹腔下部，因此在放疗中或放疗后, 由电离辐射导致的直肠炎是常见的并发症之一。其发生率高达50%～70%[2]，严重影响治疗的连续性和治疗效果，有些甚至影响患者的预后及生活质量。国内外研究人员对放射性直肠炎(RP)的防治研究一直比较关注[3-6]，但仍未获得突破性进展，放射性直肠炎动物模型的建立是研究中非常关键的步骤。确定模型建立的照射方法，制作稳定的动物模型对节省动物资源和减少实验消耗至关重要。本研究采用X射线单次大剂量局部照射SD大鼠，对其临床表现和组织病理学的改变进行观察，旨在探索建立大鼠放射性直肠炎模型的方法，为放射性直肠炎的治疗药物开发和评价提供理论依据和研究基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级雄性SD大鼠60只，体重250～280 g，北京维通利华试验动物技术有限公司，生产许可证号：SCXK(京)2016-0006。饲养于中国辐射防护研究院GLP中心，许可证号：SYXX(晋)2018—0005。

1.2 辐照源

Elekta Synergy直线加速器，X射线出束能量6 MeV，英国Elekta Limited公司生产，山西白求恩医院放疗科提供，由河北嘉盛剂量服务有限公司检定，检定有效期为2021年11月。

1.3 动物分组及照射

1.3.1动物分组

照射前将动物称重，根据动物体重按分段均衡随机分组法将动物进行分组。

为精确探明模型的最适剂量，本实验进行了两次造模，第一次剂量范围较大，分为对照组、10 Gy照射组、15 Gy照射组、20 Gy照射组、25 Gy照射组、30 Gy照射组；第二次剂量间隔较小，分为对照组、14 Gy照射组、15 Gy照射组、16 Gy照射组、17 Gy照射组、18 Gy照射组。每组动物数均为5只，性别均为雄性。

1.3.2照射方法

将大鼠采用2.5%的戊巴比妥钠溶液腹腔注射麻醉，以仰卧位局部单次大剂量照射。

第一次造模的照射范围为大鼠下腹部，源皮距为100 cm，照射剂量率为600 MU/min，射野均匀性为3%。照射剂量为 0、10、15、20、25和30 Gy。未照射部位不采取遮挡措施。

第二次造模的照射范围缩小为自耻骨联合上缘至肛门，源皮距为100 cm，照射剂量率为300 MU/min，射野均匀性为3%，照射剂量为 0、14、15、16、17和18 Gy。未照射部位不采取遮挡措施。

照射结束，将照射组与空白对照组大鼠置于相同环境中继续饲养14天。

1.4 观察指标

照射后第2天开始隔日称取动物体重、每周称量摄食量，每日观察动物的反应速度、活动度、排便情况、有无肛周脱毛、肛门出血和死亡等情况。

1.5 病理组织学观察

照射后第14天将大鼠麻醉，剖取肛门以上直肠组织约3 cm，用生理盐水冲洗，取1 cm×1 cm大小组织，以10%福尔马林固定后石蜡包埋，HE染色，光镜下观察直肠组织病理改变。

1.6 统计学分析

采用SPSS 25.0统计软件进行数据分析，计量资料服从正态分布者采用单因素方差分析，如果不符合正态或方差齐性用非参数Kruskal-Wallis检验分析，以p<0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况观察

第一次造模：各组照射后动物均出现不同程度的活动量减少，反应速度减慢；照后第3天，15 Gy照射组、20 Gy照射组、25 Gy照射组和30 Gy照射组的动物出现排稀便现象；照后第4天，20 Gy照射组、25 Gy照射组和30 Gy照射组动物均出现鼻腔出血现象。

第二次造模：各组照射后动物均出现不同程度的活动量减少，反应速度减慢，照射部位脱毛等现象。

2.2 体重

第一次造模：照射当天，动物体重组间比较差异不显著；照后第2天至照后第12天，动物体重组间比较差异显著，其中，10 Gy照射组在照后第2天动物体重达到最低，之后有所恢复，但与对照组各时间点体重比较仍有显著差异。

第二次造模：照射当天，动物体重组间比较差异不显著；照后第3天至照后第15天，各组动物体重均呈现不同程度的增长，但17 Gy照射组、18 Gy照射组较其他组增长幅度减小。

2.3 动物生存情况

第一次造模：照射后第4天，30 Gy照射组出现2只死亡动物；照后第5天，20 Gy照射组出现3只死亡动物，25 Gy照射组出现5只死亡动物；照后第6天，15 Gy照射组出现2只死亡动物。10 Gy照射组存活率100%；15 Gy照射组存活率40%；20 Gy、25 Gy、30 Gy照射组存活率0%，动物死亡前均出现背毛不齐，消瘦等症状。

第二次造模各组均未有动物经照射死亡。

2.4 摄食量变化情况

第一次造模：照后第一周，除对照组正常摄食外，其余照射组均未摄食；第二周，存活动物恢复摄食，与对照组比较，10 Gy照射组摄食量差异不显著，15 Gy照射组摄食量显著减少。

第二次造模：照后第二周，除对照组正常摄食外，其余照射组均较第一周摄食量减少。

2.5 病理组织学形态观察

第一次造模：从外观看，照射部位均出现不同程度的背毛脱落现象，与对照组比较照射组存活动物肠充血较明显；通过对直肠进行HE染色，在200倍光学显微镜下观察发现黏膜柱状上皮、固有层大肠腺、黏膜肌层、黏膜下层、肌层以及外膜均未见异常。

第二次造模：从外观看，照射部位均出现不同程度的背毛脱落现象；通过对直肠进行HE染色，在200倍光学显微镜下观察发现，与对照组相比，14 Gy照射组、15 Gy照射组、16 Gy照射组、17 Gy照射组和18 Gy照射组动物盲肠、结肠的粘膜均出现轻微/轻度炎细胞浸润；15 Gy照射组、16 Gy照射组、17 Gy照射组和18 Gy照射组动物直肠的粘膜均出现轻微/轻度炎细胞浸润，部分动物出现粘膜水肿，其中，17 Gy照射组和18 Gy照射组病变程度略重，其余各组病变程度未见明显差异。

3 讨论

本实验通过对两次造模的数据分析认为，照射时的照射野范围和剂量率与造模结果有很大关联。扈婷婷等[2]将雄性 Wistar 大鼠采用直线加速器单次盆腔局部照射的方法进行照射，不用铅块遮挡，照射野面积为3.5 cm×5 cm，源皮距100 cm，剂量率为300 cGy/min，认为19～21.5 Gy能成功诱导大鼠急性放射性直肠炎。徐伟等[3]选用SD大鼠采用与扈婷婷同样的照射方法，照射野面积5 cm×8 cm，周围以厚铅块屏蔽，认为12 Gy为放射性直肠炎模型成功的剂量。李宜放等[7]选择 Wistar大鼠，照射野面积3 cm×4 cm, 其余部位以厚铅块屏蔽，源皮距80 cm，剂量率300 cGy/min，确立最佳照射剂量为20 Gy。Seunghee等[4]的研究发现下腹部照射 17.5 Gy可引起大鼠轻中度直肠炎，Korkut等[4]的研究用 20 Gy 建立了大鼠中重度模型，Northway等[5]的研究表明，照射20 Gy或更高剂量，可引起大鼠直肠较严重的损伤。综合国内外研究发现，大鼠造模成功的剂量不尽相同，可能与大鼠体质量、品种和照射方法等相关联[8]。扈婷婷[2]等认为，照射方法对实验结果的影响很大。

本实验综合成活率和RP的组织病理学表现，第一次造模结果中，15 Gy能保证一定的成活率但病理学改变程度轻微。因此第二次造模时尽量避免对小肠的照射，同时降低剂量率，提高照射剂量，在保证存活率的前提下增加对直肠的损伤程度。结果显示照射后各组动物体重呈不同程度的增长，其中18 Gy组的增长幅度减小，各照射组的摄食量出现减少，未有动物经照射死亡，光镜下观察发现，与对照组相比，5个照射组动物盲肠、结肠的粘膜均出现轻微/轻度炎细胞浸润；除14 Gy组，其余照射组动物直肠的粘膜均出现轻微/轻度炎细胞浸润，部分动物出现粘膜水肿，其中，17 Gy照射组和18 Gy照射组病变程度略重。因此认为18 Gy 在保证了大鼠生存率的前提下使大鼠直肠组织病理学发生改变，这个剂量可视为放射性直肠炎模型的造模成功剂量，有望为今后进一步研究奠定基础。