中国马铃薯花药培养关键技术研究进展

朱 旭，李 楠，杨春明，李 闯，王忠伟，贺红霞*

（1.吉林省农业科学院农业生物技术研究所，吉林 长春 130033；2.吉林省农业科学院经济植物研究所，吉林 公主岭 136105）

马铃薯在中国已有400多年的栽培历史，至今已成为第四大粮食作物。中国人对马铃薯具有深厚的感情，在漫长的传统农耕时代，马铃薯作为赖以裹腹的主要粮食作物，使无数人受益。而马铃薯又以其丰富的营养价值，成为中国饮食烹饪文化不可或缺的部分。中国马铃薯产量居世界首位，但在马铃薯育种研究上起步较晚，几十年来虽然取得了很大成绩，但育种方面因资源、投入、体制等的先天不足，与国际先进水平的差距很大。

马铃薯普通栽培种是同源四倍体，遗传基础狭窄，利用传统的种内杂交不仅工作量大、效率低，很难选育出优良的马铃薯新品种。远缘杂交可以引入不同种或属的优良基因，尤其是马铃薯野生种的基因，存在远缘杂交不亲和现象，技术上存在一些困难。花药培养可以实现在二倍体水平上育种，将大幅度提升选择效率，利用花药培养和2n 配子技术，还可以解决马铃薯实生种子后代分离的问题[1]。马铃薯野生种具有优良的抗病抗逆基因，而且存在低还原糖含量，延长贮藏时间等利于提升马铃薯加工品质的基因[2]。但由于倍性的问题，通过常规的杂交育种很难将二倍体野生种马铃薯中的优质基因输入到普通栽培四倍体马铃薯中，而花药培养产生的双单倍体，可以成为实现二者之间的基因交流的桥梁[3]。花药培养是在离体条件下，将发育到一定时期的花药接种到适宜的培养基中，产生胚状体或愈伤组织，最终使其发育分化成为完整植株的过程[4,5]。本文概述了花药培养在马铃薯育种中的意义以及目前中国马铃薯花药培养关键技术的研究现状，并对未来研究工作提出建议，为中国马铃薯花药培养技术的发展提供参考。

1 花药培养关键技术

1.1 外植体的选择

1.1.1 基因型

植物基因型决定着花药培养成功与否以及难易程度[6]。从花药培养诱导胚状体或愈伤组织的能力来看，在植物属间、种间或品种间均存在很大的差异[7]，并且这种能力是可以遗传的[8]。广泛选择基因型非常重要，中国学者20世纪80年代初，开展马铃薯花药培养试验，不断地筛选对诱导产生反应的品系，诱导的品种有中晚熟品种也有早熟品种，还有抗晚疫病品种。通过花药培养获得过双单倍体的四倍体栽培种有‘渭薯1号’[9]、‘高原7号’[10]、‘京丰1号’‘郑州798-24’[11]、‘中心24’[12]、‘波C’‘讷16’‘克新13号’‘扎列娃’[13]、‘克97G8’‘白俄3’[14]、‘内薯7 号’‘春薯4 号’[15]，马铃薯中心品种‘S17’‘T3’‘KW47’[3]。此外，贺苗苗[16]以‘青薯2号’‘高原4号’‘青05-12-6’为材料诱导出了绿色植株，但倍性鉴定并未提及。

1.1.2 生理状态

供体植株的生长条件（光周期、光强、温度和矿质营养）以及生理状态也能影响花药培养效果[17]。高湘玲等[18]认为开花初期及盛花期所产生的花药比开花末期产生的花药诱导频率高，而且花蕾要选择健康植株的幼嫩花蕾。他们认为以下几种情况不适合做花药培养材料：花蕾开裂，花药裸露在外边的；早期落蕾和不成花器的；开花正常但花粉败育或花粉发芽力很低的；开花正常花药不开裂的。花药小孢子的生理状态受环境因素影响[19,20]，张凤兰等[21]、王建红等[22]的研究表明，日照长短和温度高低影响外植体胚状体的发生率，光照时间长、环境温度低的植株比光照时间短，环境温度较高条件下的植株胚状体发生率高。牟文平[23]认为花药培养受季节和采样时间的影响，春天的花药比秋天的花药更容易进行花药培养，而且花药取材尽量取开花初期至盛花期之间的，末花期的花药生理状态不好，不适宜花药培养，该结论可供马铃薯栽培气候条件差异大的地区参考。

1.1.3 发育时期

花粉的发育时期对于花药培养成功与否至关重要[24]，花粉细胞只有在其发育周期中的特定时期才对培养程序有反应[18]。大多数植物花药培养最适宜的时期是单核中晚期到双核早期，但不尽相同[7,25]，而马铃薯胚胎发生的最佳小孢子发育时期是单核早中期[26]。花粉的发育时期和其对应的生长发育特点有一定的关联，比如可以根据花药、花蕾的长度，以及花药颜色等来判断花粉发育时期，但不同品种之间有一定的差别，甚至同一花药内特定发育时期小孢子占比是不同的[3]。由于品种不同，单核中、晚期的花药长3～8 mm不等；另外在甘蓝中，同一品种的不同花期单核时期的长度也有区别。马勇斌[27]选用5份甘蓝材料做了甘蓝植株不同花期小孢子单核靠边期花蕾长度变化观察，发现同一品种，不同花期单核靠边期花蕾的长度有所不同，在初花期，花蕾长度最短，范围差值最大；盛花中、后期最长，花蕾长度范围差值最小。这一现象在马铃薯中是否存在，尚未有报道。小孢子发育时期与生长发育特点是密切相关的[28]，为了提高花药培养效率，可以通过直观的对应性状取材，减少试验操作步骤，降低污染率。

1.2 外植体消毒

灭菌操作是植物组织培养的关键技术，会影响整个试验的效率和数据统计结果[3]。植物组织培养过程中如果出现污染，则造成大量人力、物力和财力的浪费。对于马铃薯花药培养这种取材有明显季节性的试验，消毒处理更要注意。中国学者大多采用两种消毒剂组合在一起使用，酒精+升汞，酒精+饱和漂白粉，酒精+次氯酸钠，酒精所用浓度一般为70%或75%，浸泡时间30 s[16]；升汞浓度一般为0.1%，浸泡时间10～15 min[16]；次氯酸溶液浓度一般为10%，表面灭菌15 min[8]。以上消毒处理结束后，都用无菌水冲洗3～5次。高湘玲等[18]建议，采蕾应在晴天数日之后进行，雨后采蕾污染率达100%。

1.3 预处理

1.3.1 预冷处理

预冷处理是指在花药培养之前，将材料置低温条件下，培养一段时间再进行接种。预冷处理具有可以提高花药培养愈伤组织诱导率、促进成胚率，而且在烟草、小麦、大麦、水稻等许多植物中已经被证明。经过低温处理的花药，花药中花粉的胚胎发生能力提高，活力延长，落入试验体系中有效花粉的数量增加，从而提高了花粉胚胎的诱导率[29,30]。但在马铃薯花药培养研究中，低温处理是否对愈伤及胚状体的诱导有利，尚存在争议。中国学者戴朝曦[10]、贺苗苗[16]和卢翠华等[24]在试验中将花药低温处理1～2 d并在最后的试验中得到了双单倍体；王玉娟等[9]和卢翠华等[24]认为对花蕾进行适当低温处理，可提高愈伤组织的形成和分化能力；贺苗苗[31]对低温处理、热激处理的时间进行了研究，该研究证明高低温相结合的预处理方式比单独使用一种，马铃薯的愈伤诱导率高；李霞等[32]用原始二倍体栽培种的杂种无性系为试验材料，研究预处理温度对二倍体花药培养中愈伤组织诱导情况，结果表明4℃低温预处理48 h可以明显提高花药愈伤组织诱导率；而朱明凯等[11]将花药在4℃低温处理24，48和72 h，与未经低温处理的花药进行对比，发现低温处理过的诱导效果与对照不处理的无明显差别，王蒂等[8]也认为低温处理对马铃薯花药培养无益。出现以上不同的结论，可能是由于材料、培养基的不同，原因有待研究。

1.3.2 热激处理

热激处理是指将接种后的花药或花粉置于高温条件下培养一段时间，然后再移至正常温度下继续培养。不同物种或基因型最佳热激处理的温度和时间是不同的[6]。王蒂等[8]认为高温预处理能够显著地增加胚状体数量。庄军平[33]也认为合适的短时间高温处理有助于提高愈伤组织的诱导率和胚状体的产生。马铃薯花药热激处理常用温度32～38℃，处理时间1～3 d。

1.4 培养基成分

花药和花粉对营养成分的要求因基因型而不同，营养成分对培养效果产生直接的影响，是单倍体植株诱导成功与否的关键，也决定着发育途径[34]。马铃薯花药培养常用基本培养基为MS培养基，并在此基础上添加一些对愈伤及胚状体诱导有益的成分。

1.4.1 激 素

戴朝曦[10]认为胚状体分化对培养基要求不严格，在愈伤诱导培养基里可以直接分化出苗。王蒂等[8]、戴朝曦[10]和朱明凯等[11]均表示胚状体不需要转到分化培养基，愈伤组织的分化需要较高的细胞分裂素，而且6-苄氨基嘌呤（6-benzylamino-purine，6-BA）和激动素（Kinetin，KT）这两种细胞分裂素混合使用的效果更好。梁彦涛[26]认为不添加激素或添加低浓度的激素有利于胚状体植株的再生，其在试验中获得的胚性愈伤组织在无任何激素的MS培养基中的分化率高于添加了6-BA和KT的培养基。

1.4.2 硝酸银

在组织培养中，外植体的褐化是普遍存在的，严重影响外植体的脱分化和再分化，并且马铃薯花药褐化率非常高，在50%以上[26]。在培养基中加入硝酸银，有两方面的影响，一是能够促进胚状体的发生，二是能够减轻或延缓花药的褐化。冉毅东和戴朝曦[12]对硝酸银诱导马铃薯双单倍体及一倍体的效果做了试验，认为花药褐化程度和基因型有关。外植体在培养过程中产生的乙烯能够使马铃薯花药的褐化速度加快，在花药诱导培养基中加入50～100 μmol/L硝酸银，可显著提高胚状体的发生率，胚状体出现的频率最高可达16%，同时可提高胚状体的分化率；硝酸银还可延缓花药的褐化，延长胚状体形成期限13～20 d，在试验中，不同基因型材料对相同浓度硝酸银的反应是不一样的，说明不同材料产生乙烯的程度可能是不同的[12]。赵欣[15]和梁彦涛[26]硝酸银的梯度试验，均证明随着硝酸银浓度的增加，愈伤组织诱导率先增加后降低，硝酸银的添加量并不是越大越好。硝酸银浓度过大，对材料有毒害作用。梁彦涛[26]认为30 mg/L的硝酸银是降低花药褐化的最佳浓度，赵欣等[35]试验结果显示，培养基中加入20 mg/L的硝酸银愈伤组织诱导率最高。卢翠华等[24]在培养基中加入100 mg/L硝酸银同样诱导出了双单倍体。不同基因型适宜的硝酸银添加量可能不同，这需要进一步验证。

1.4.3 活性炭

在培养基中加入活性炭，有利于花粉胚状体或愈伤组织的发生，从而提高花粉植株的诱导率。在马铃薯的花药培养基中加入0.5%～1.0%的活性炭可以有效地提高花粉植株的数量[7]。活性炭在花药培养中对花药褐化的影响显著，梁彦涛等[36]通过试验得出对马铃薯花药褐化有显著影响的因素最主要是活性炭、其次是硝酸银；并且活性炭以0.2 g/L效果最佳。赵欣等[35]在培养基中分别添加0.25，0.50 和0.75 g/L的活性炭，以不加活性炭为对照，结果显示添加0.50 g/L时，参试的两个品种愈伤诱导率最高。其他各研究论文中使用的活性炭的添加量差别也较大，1～3 g/L[3,10,16]不等。

1.4.4 马铃薯提取液

马铃薯提取液具有均衡的氨基酸组分，对许多植物花药培养都是有益的。马铃薯提取液对胚状体的产生是有利的，浓度为50 g/L[10]效果较好。

1.5 转分化培养基的时机

胚状体和愈伤组织冲破花药壁肉眼可见时，转入分化培养基[10,11]。花药培养3～8周后，药壁破裂，愈伤组织或者花粉植株从开口处长出，直径达到2～3 mm时放到分化培养基上进行分化培养[7]。高湘玲等[18]也认为愈伤组织长到1～2 mm 时，可转入分化培养基，过大过老的愈伤组织，不能迅速地诱导出植株来，及时的将愈伤组织转入分化培养基是很重要的。

1.6 再生过程

花粉植株的再生途径有两种，分别是胚状体途径和愈伤组织途径。戴朝曦[10]共接种花药20 720枚，获得了愈伤组织204块，胚状体24个和3块胚性细胞团。这3种组织均获得了双单倍体。试验表明胚状体的分化频率是愈伤组织分化频率的3 倍。试验中所获得的胚性细胞团是由白色、松散、小米状的小颗粒组成，经过分化培养基5次继代后，开始大量分化苗。能分化苗的愈伤组织是淡黄色且比较紧实，而花丝和花药壁起源的愈伤组织是白色、半透明而且比较松散。

以愈伤组织诱导成植株，染色体倍性差异很大，而以胚状体诱导成植株，染色体倍性均为双单倍体。因此，以胚状体直接诱导成苗比以愈伤组织途径有明显优点。首先是数量多，一个胚性细胞团可诱导出10～50个胚状体。其次是速度快，胚状体是从单细胞直接分化成苗，因此比愈伤组织诱导成苗要快的多，而且从胚状体诱导成苗的频率比愈伤组织要高。再者，以胚状体途径成苗染色体倍性稳定，均为双单倍体，而愈伤组织途径倍性复杂。因此根据目的，今后重点是掌握诱导胚状体的条件，提高花粉植株的诱导频率[11]。

1.7 倍性鉴定

由于受到花药壁的影响，花药培养再生的植株可能来源于花粉也可能来源于花药壁，倍性鉴定是很有必要的。倍性鉴定有形态学鉴定、细胞学鉴定和流式细胞仪鉴定以及生化或分子标记鉴定法等。直接对花粉植株根尖进行染色体数目鉴定的细胞学鉴定是最有效、最可靠的方法[37]，也是马铃薯单倍体鉴定的常用方法。

1.8 培养条件

1990年之前，由于试验条件受限，花药培养诱导阶段多在18～25℃的变温条件下培养，散射光或连续光照培养，分化阶段每天补充光照8～16 h，光强2 000～2 500 lx。王蒂等[8]则在自然散射光下，加白色灯2 000 lx昼夜照明，4～6周形成胚状体。

1990年之后，花药培养大多在25℃恒温条件下进行，卢翠华等[24]在弱光条件下每天光照培养l6 h。王梓全等[29]、梁彦涛等[36]则在黑暗条件下，诱导愈伤组织或胚状体。分化阶段光强为2 000～2 500 lx，光照16 h/黑暗8 h。

2 花药培养制约因素

自从曼陀罗花药培养成功获得单倍体植株后，许多植物利用花药培养技术也相继获得了成功。中国从20世纪80年代初就开展了马铃薯花药培养的研究工作，虽然取得了很大的进步，从无到有，也从一些基因型中诱导出了双单倍体，但近20年间，马铃薯花药培养的理论研究还不够深入、系统，还没有建立起一套完善的应用体系。这可能有三方面因素限制了花药培养在马铃薯育种中的应用。

（1）基因型的限制：马铃薯普通栽培种的花药诱导成苗频率很低，如何提高诱导成苗率是今后花药培养的重要问题。品种、培养基不同诱导效果差异很大，说明具有不同基因型的品种对同一生长条件适应性不同，同一品种对不同培养基又有明显的选择性[11]。有研究用80多个品种进行花药培养，其中只有12个品种获得愈伤组织，而真正获得单倍体植株的只有两个品种[7]。

（2）试验材料供给受限：马铃薯花药的采集具有明显的季节性，而且马铃薯花药极易褐化，一般花药采集地与实验室不在同一地点，往返两地不仅增加了褐化风险，也增加了时间成本，给花药培养带来许多困难。

（3）科研投入不足：花药培养操作繁琐、工作量大、花药培养效率较低，优化培养体系需要投入较大精力，这方面研究投入远远不够。

3 发展建议

3.1 广泛的筛选基因型

基因型对马铃薯花药培养是否成功起决定性作用，因此广泛的筛选适宜花药培养的基因型很有必要，一方面可以充分挖掘优良的隐性基因，另一方面培育出的双单倍体可以与二倍体野生种杂交，获得野生资源中优良的遗传性状，提高育种效率。

3.2 就近建立花药培养材料试验基地

影响马铃薯花药培养的因素很多，而花药培养工作能否高效开展，和试验材料的供给有很大的关系。马铃薯花药的采集具有明显的季节性，马铃薯的花蕾形成、开花及受精结实对气候条件很敏感，在温室种植的马铃薯很难开花，花蕾形成后很容易落蕾，而且有花药裸露在外的现象，难以作为花培材料。吉林省属于北方一季作区，一年只有一次开花期，花期3～4周，尤以初花期和盛花期的花药最适合培养，所有的花药培养试验均集中在短短2～3周，应在实验室周边建立花药采集苗圃，避免往返取样耽误时间，可根据实验需求随用随取，并降低试验材料褐化风险，提高花药培养工作效率。

3.3 加强花药培养的科研投入，完善育种技术

杂交育种目前是中国最常用的育种方法，但选择效果仍然很差，在野生种的利用方面也存在一些技术问题。马铃薯双单倍体有着独特的育种优势，将杂交育种和生物育种相结合，将大幅度提高育种效率。要想实现这一目标，必须提高花药培养的科研投入，让更多的科研人员参与到花药培养技术研究中，不断完善培养技术、提高培养效率，加大花药培养技术在马铃薯育种中的利用，逐步建立完善的应用体系。