环状RNA对胃癌诊断及预后的影响

李勇瑜，宋 健

（海南医学院：1临床医学专业；2附属肿瘤医院消化内科，海南海口 570312）

胃癌是消化道恶性肿瘤的常见病，具有早期易漏诊，中、晚期预后不良的特点。尽管目前内镜下活检仍是胃癌确诊的主要手段，但是其价格贵、耐受性差，患者普遍接受度不高，且癌胚抗原（CEA）、糖抗原199（CA19-9）等特异性、敏感度低的非特异性肿瘤相关抗原对胃癌更不具有针对性提示意义。近年随着RNA 测序技术的不断进步，越来越多的cir⁃cRNA在胃癌患者中被检测出来，其在胃癌组织及其癌旁组织与血浆中的表达差异性与胃癌的发生发展、诊断及其预后关系不断被深入发掘，使circRNA成为胃癌诊断及其预后的新型生物标志物奠定了一定的基础。

1 circRNA的概述

1.1 circRNA的特征

circRNA首次被发现存在于RNA植物病毒中[1]。随后发现少部分的真核生物中也存在相关的cir⁃cRNA，但相关文献报道较少，学术界普遍认为其是DNA 转录过程中错误剪接的产物[2]。随着RNA 测序技术的深入研究，circRNA 被发现广泛存在于人体组织细胞、血液中[3-4]。与线性RNA（linearRNA）相比，circRNA 具有以下特征[3-6]：①稳定性：由于circRNA反向首尾连接形成封闭环状结构，无游离5′帽和3′尾，有抗RNase 及RNA 外切酶的特性，使其具有高度保守性、稳定性以及长半衰期（＞48 h）。②分布特异性：通过异常剪接外显子或内含子序列来源的前体mRNA 可产生不同的circRNA，前者主要定位于细胞质，后者则定位于细胞核。③表达差异性：在人体不同组织或体液中差异表达，对肿瘤、疾病的发生发展具有重要意义。④数量多：多种蛋白基因编码可共同转录产生数量丰富的circRNA。

1.2 circRNA的类型和产生机制

产生circRNA 的供体种类繁多，但形成的cir⁃cRNA 主要分成四类[3-6]：纯外显子的circRNA（ecir⁃cRNA）、纯内含子的circRNA（ciRNA）、外显子-内含子的circRNA（eiciRNA）以及前体tRNA 形成的cir⁃cRNA（tricRNA）。另有研究表明染色体易位畸形[7]和环形DNA病毒[8]也可形成circRNA。不同于线性RNA传统的剪切方式，circRNA的产生机制可能包括：①直接反向剪接、外显子跳跃和RBP抖动：直接反向剪接是ecircRNA 和eiciRNA 最常见的环化方式，含有ALU重复序列的特殊前体mRNA通过反向碱基互补配对后剪切形成ecircRNA[3]。外显子跳跃是通过剪接体提供的供、受体位点连接两端外显子构成套索选择性剪接产生ecircRNA[3]。RNA 结合蛋白（RNA-binding proteins，RBPs）通过识别两侧内含子位点促进外显子反向剪接形成ecircRNA 即RBP 抖动[9]。三种机制过程中若保留内含子则可形成eiciR⁃NA。②内含子套锁驱动环化：富含GU 碱基和（或）C碱基保守序列的前体mRNA 促进内含子反向互补，剪接3′末端驱动套索环化形成ciRNA[3]。③tricRNA是前体tRNA 内含子经剪接环化形成[10]。④其他：sn⁃RNP（小核核糖核蛋白）结合前体mRNA可促进环化形成[11]。

1.3 circRNA的生物学功能

1.3.1 充当微小RNA（microRNA，miRNA）海绵 充当miRNA 海绵是circRNA 最突出的功能。circRNA作为miRNA的内源性抑制剂，通过竞争性抑制miR⁃NA结合目标mRNA基因，从而影响蛋白质翻译和基因调控。有研究表明，源于HIPK3 基因Exon2 的circHIPK3 可结合9 种miRNA 与有18 个结合位点，竞争性结合miR-124 产生负调节作用，促进肿瘤细胞生长增殖[4]。ciRS-7是miR-7的典型海绵，含74个靶位点，高效结合miR-7并促进其靶基因表达，增加肝癌、结肠癌等肿瘤的发展风险[12]。然而，有研究证实circRNA并非有多miRNA靶点才具有调控基因的能力，如circTP63 可作为miR-873-3p 海绵，特异性结合后可正调控miR-873-3p 靶基因FOXM1 表达，促进肺鳞状细胞癌的进展[13]。circTGFBR2 能够与miR-107 相互作用，抑制miR-107 表达同时促进该靶点基因TGFBR2 表达上调，抑制鼻咽癌细胞增殖和侵袭[14]。

1.3.2 调控基因表达 不同的circRNA 有不同的调控亲本基因表达的方式。已有研究表明，ciRNA 与eiciRNA主要定位于细胞核中，可通过顺式调节方式参与RNA 聚合酶II 复合物促进亲本基因转录。例如，Li 等[15]证明circEIF3J、circPAIP2 与其亲本基因EIF3J和PAIP2的表达成正相关。Lai等[16]认为来源于SERPINB5 和GDA mRNA 编码基因的hsa_circ_0047905 和hsa_circ_0138960 与对其亲本基因有正调控作用。Zeng等[17]研究表明circSIRT7与PolⅡ结合作为其亲本基因SIRT7 的顺式因子。ecircRNA 主要定位于细胞质中，可与RBPs 结合调控mRNA 表达。另外，eiciRNA 可充当RBPs 海绵，具有类似ecir⁃cRNA 的作用。例如，Du 等[18]研究发现，circFoxo3 与FAK 和HIF1α蛋白相互结合，可调节衰老和应激抗性。

1.3.3 翻译蛋白质功能 circRNA 非绝对意义上的非编码RNA，少部分circRNA 可与核糖体结合进而参与翻译过程。Yin等[19]在证实circFAM188B具有促进鸡骨骼肌卫星细胞增殖能力的基础上，进一步发现其具有编码多肽circFAM188B-103aa 的潜力，且后者与其亲本转录物circFAM188B 的作用一致。此外，在人体脑细胞中，来源于SHPRH基因和FBXW7基因的circSHPRH和circFBXW7可分别编码多肽和蛋白质，抑制胶质瘤的发生发展[20-21]。有研究证实，circErbin 可吸附miR-125a-5p 和miR-138-5p，协同靶向真核细胞翻译起始因子4E结合蛋白1（4EBP-1），从而介导cap 非依赖性HIF-1α蛋白翻译，促进结直肠癌的生长及转移[22]。然而，Wu等[23]却研究发现cir⁃cYap有负调控作用，通过结合eIF4G和PABP阻止起始翻译。

综上所述，circRNA 不仅可以充当miRNA 和RBPs海绵对mRNA发挥调控作用，还可以调控蛋白质翻译影响疾病的发生发展。此外，研究表明红景天苷可通过上调hsa_circ_0000064 水平来减弱缺血再灌注损伤心肌细胞的自噬和凋亡，有效改善心功能，缩小心肌梗死面积[24]。然而，circRNA 的研究绝非止步于此，更多的生物学功能有待进一步发掘。

2 circRNA与胃癌的关系

胃癌是消化道恶性肿瘤中的常见病，其预后与肿瘤的侵袭、转移有关。虽然目前胃癌的治疗手段有很大的提升，但患者的预后、生存情况并未有效改善，其根本原因在于不能及时进行早期诊断。随着研究深入，发现circRNA与胃癌的发生发展密切相关，使其作为胃癌诊断、预后评价的生物标志物存在着巨大潜力。

2.1 circRNA与胃癌发生、发展的关系

circRNA 通常在转录或转录后水平调控基因表达，其中主要以充当miRNA海绵、circRNA表达失调以及circRNA 作为上皮细胞-间质转化（epitheli⁃al-mesenchymal transition，EMT）过程中重要组分参与胃癌的进展过程。Niu 等[25]首次发现hsa_circ_0001829 作为miR-155-5p 的分子海绵，调节其靶基因SMAD2表达，并通过影响细胞周期进程及凋亡率来促进胃癌细胞增殖、迁移和侵袭。Pu等[26]研究发现cirCUL3通过激活miR-515-5p促进信号转导和转录活化因子3（STAT3）的表达，从而提高己糖激酶2（HK2）的转录水平导致胃癌细胞的增殖和葡萄糖消耗加快。有研究表明，circMTO1 通过竞争性抑制miR-199a-3p 活性，上调miR-199a-3p 下游靶基因PAWR表达水平，可提高胃癌细胞凋亡率，减少细胞侵袭和迁移[27]。此外，Ma 等[28]研究表明，hsa_circ_0004872 能通过海绵化miR-224 促进其下游靶点p21和Smad4表达上调，并通过Smad4反向抑制RNA编辑酶ADAR1 形成负调控环来影响hsa_circ_0004872的降解，从而抑制胃癌细胞增殖、迁移和侵袭。Guo等[29]发现circREPS2充当miR-558海绵，可上调RUNX3的表达，使胃癌细胞中的β-连环蛋白信号失活发挥肿瘤抑制作用。

circRNA 表达失调也可调控胃癌的发生、发展。有部分研究发现，如hsa_circ_0001829[25]、circCUL3[26]在胃癌组织和细胞系中显著上调，皆有促进胃癌细胞增殖的作用。circMTO1 在胃癌细胞系和组织中表达明显下调，其低表达水平与预后不良呈正相关，上调circMTO1可抑制肿瘤生长[27]。此外，在胃癌组织中hsa_circ_0004872[28]、circREPS2[29]低表达与TNM分期与肿瘤大小有关，上调表达时显著抑制胃癌细胞的增殖、迁移、侵袭及体内肿瘤的发生。

EMT过程影响癌细胞的侵袭、转移，主要是由于上皮细胞过渡成间充质细胞，后者具有迁移能力可侵袭机体的各个部位。有研究发现，circREPS2 表达升高可负调控EMT，抑制细胞增殖、侵袭。hsa_circ_101882通过影响E-cadherin、N-cadherin、vimentin和Snail的表达水平正调控EMT过程[29-30]。

2.2 circRNA对胃癌的诊断价值

circRNA 与肿瘤的关系是近年的研究热点，其中circRNA 在胃癌组织及其癌旁组织，甚至是血浆中的表达差异更是为胃癌的诊断提供有力的依据。ROC 曲线的AUC 是描述诊断试验真实程度的常用方法。基于qRT-PCR 扩增技术，Lu 等[31]发现在胃癌组织中hsa_circ_0067582 和hsa_circ_0005758 表达均显著降低，其中hsa_circ_0067582 与CEA 水平和临床分期呈正相关，而hsa_circ_0005758 与CEA 水平和神经周围浸润呈正相关，两者ROC曲线下面积AUC 分别为0.671 和0.721，敏感性为55.2%和75%以及特异性为75%和67.7%，具有成为胃癌诊断的潜在标志物可能。Kong 等[32]通过采用高通量测序法在胃癌组织及癌旁组织中进行大规模基因筛选，共鉴定出25303 个circRNAs，其中2007 个circRNAs 具有差异表达，并进一步验证hsa_circ_0001821在胃癌患者的组织及全血标本中表达降低，经AUC分析显示全血中的hsa_circ_0001821 对胃癌患者的诊断效率不仅优于胃癌组织（0.872，95%CI:0.767～0.977 vs 0.792，95%CI:0.723～0.861），且敏感性和特异性更高于CEA、CA199、CA125 传统的标志物（0.872，95%CI:0.767～0.977 vs 0.839，95%CI:0.740～0.937;0.771，95%CI:0.649～0.893;0.742，95%CI:0.613～0.871），更甚者两者联合可使AUC 高达0.933，有效提高诊断胃癌的准确度。同年，研究cir⁃RNA作为胃癌诊断的新型标志物的队伍逐渐扩大。有研究显示，hsa_circ_0006848 在早期胃癌患者的胃癌组织和血浆中均呈低表达，通过血浆样品构建ROC 曲线的AUC 为0.733，联合CEA、CA19-9 及CA72-4 可 使AUC 升 高 至0.825，表 明 了 血 浆hsa_circ_0006848 有望能作为一种新的无创性诊断早期胃癌的生物标志物[33]。还有一部分circRNA具有成为诊断胃癌的生物标志物潜能，如Xie 等[34]发现hsa_circ_074362 在胃癌、胃炎组织及胃癌细胞系中表达水平均显著下调，其胃癌组织的AUC 为0.630。Tang等[35]证实了circKIAA1244在胃癌患者的病变组织及血浆样品中的表达低于正常对照组，其血浆样品的AUC 为0.748，且外泌体中circKIAA1244 表达与血浆水平无差异，进一步扩大了胃癌诊断载体的范围。以上研究表明了circRNA 在诊断胃癌方面有重要意义，然而目前大多数circRNA 的检测皆在活检组织中进行，只有少部分circRNA可在血浆、外秘体中被发现，并且通过circRNA 检测来早期诊断胃癌的相关报道仍较少。因此，circRNA从研究过渡到临床应用的道路还很漫长。

2.3 circRNA对胃癌的预后价值

circRNA 与胃癌临床病理特征的关联性，使其具有评价胃癌预后的潜力。通常来说，circRNA在胃癌中低表达可能与患者的预后成正比，而高表达则呈反比。有研究显示，hsa_circ_0000419 在胃癌细胞系、癌组织和胃癌患者血浆中的表达水平显著降低，其中胃癌组织hsa_circ_0000419 水平与细胞分化、Borrmann 型、总生存率和无病生存率相关，而血浆hsa_circ_0000419水平与肿瘤分期、淋巴结转移和远端转移、静脉和神经周侵袭呈正相关，可导致患者预后不良[36]。Deng 等[37]研究发现，circRHOBTB3 在胃癌细胞系和胃癌组织中表达下调，其低表达与肿瘤分期显著相关，而与其他临床病理参数无显著相关性，且对比circRHOBTB3 低表达组，circRHOBTB3 高表达组患者的整体生存期明显延长。还有研究表明，circCUL3[26]、hsa_circ_101882[30]在胃癌组织中高表达与患者的临床分期密切相关，一定程度上可降低患者的总生存率。在胃癌患者样本中，hsa_circ_0004872[28]、circREPS2[29]、hsa_circ_0006848[33]低表达与肿瘤体积大小相关，hsa_circ_0004872[28]、hsa_circ_0001821[32]、hsa_circ_0074362[34]、circKIAA1244[35]低表达与淋巴结转移相关，而circREPS2[29]、hsa_circ_0006848[33]、circKIAA1244[35]低表达与TNM 分期、病理分化程度显著相关。以上研究表明，circRNA的表达失调对评估胃癌的预后有一定的应用价值，但目前在血浆等体液中检测circRNA表达水平的技术仍不成熟，其与组织表达水平是否具有一致性尚未有定论，且其对胃癌评估预后的可靠性、真实性还有待研究。

3 结语

circRNA 是一类特殊的非编码RNA，其闭合环形结构使其具有酶抗性，能稳定存在于组织细胞、血浆等中，对诊断胃癌及其预后评估有潜在意义。然而，关于circRNA 对于胃癌的应用价值方面还存在一些问题：首先，大多数研究未过渡到临床应用。由于研究的局限性，目前尚未有明确机制解释cir⁃cRNA的表达差异性，很难准确地通过血浆中的表达水平对胃癌进行早期诊断和预后评估。其次，cir⁃cRNA能否作为干预胃癌进程的新靶点，从而达到治疗目的。此外，目前circRNA与胃癌的相关研究大多是探讨胃癌的发展进程以及在活组织中验证不同circRNA的存在。因此，未来的研究方向主要是解决circRNA如何在肿瘤中发挥具体的作用机制问题以及如何将已有基础成果向临床应用转化问题。