循环浆细胞在多发性骨髓瘤中的研究进展

左依凡 陈兵

1 多发性骨髓瘤(multiple myeloma, MM)概述

MM是一种多发于>60岁人群的浆细胞恶性肿瘤，约占血液系统恶性肿瘤10%～15%[1]，是血液系统第二大常见恶性肿瘤。典型特征是在骨髓(bone morrow，BM)内浆细胞的恶性增殖[2]，伴或不伴有外周血和(或)其他髓外组织，如骨、软组织或皮肤的浸润[3]。已有研究表明,意义未明的单克隆丙种球蛋白病(monoclonal gammopathy of undetermined significance，MGUS)是MM的前体阶段[4]。MGUS是最常见的浆细胞肿瘤，每年约有1%的MGUS病人发生恶性转化[4]。MM病人也可能发展为最具侵袭性的浆细胞肿瘤亚型，即浆细胞白血病(plasma cell leukemia, PCL)，其特征是血液中循环浆细胞(circulating plasma cell, CPC)>2×109/L。在这种情况下，恶性浆细胞不再依赖于骨髓基质而是在外周血中循环。

目前，MM仍不可治愈。在过去的十年中，随着蛋白酶体抑制剂(proteasome inhibitors, PIs)、免疫调节剂(immunomodulatory drugs, IMiDs)及单克隆抗体等新药的临床应用，MM病人的总体生存率明显提高，但生存率存在显著差异。因此，我们需要重视和加强对疾病的监测与管理。传统的外周血/尿免疫球蛋白、游离轻链、骨髓异常浆细胞、影像学检查等检测手段已难以满足MM复杂的预后判断。新的检测项目和方法，对MM预后因素和危险分层的评估、确定治疗策略、治疗效果以及预后预测具有重要意义。本文将对CPC在MM中的意义和检测现状做一综述。

2 CPC

在实体瘤和大多数血液恶性肿瘤(包括浆细胞肿瘤)中，肿瘤扩散和远处转移最常见的方式是释放肿瘤细胞进入血液循环。循环肿瘤细胞(circulating tumor cell，CTC)是指从原发肿瘤或转移肿瘤部位释放到循环中的细胞，其也在浆细胞肿瘤中被发现, 流式细胞术可通过其表面标记物对其检测。CPC很早就在PCL病人的血液中被检测到，也在相当一部分MM病人中被检测到，在MGUS病人中检测到的较少[5]。恶性浆细胞会离开BM，通过循环进入外周血，然后再特异性归巢到BM壁龛或其他某些器官或组织，形成局部微转移灶，以一种“转移/扩散”方式将疾病扩散到整个BM及髓外组织[6]。

1962年，Ginsberg 研究团队首次证实CPC在MM病人中存在[7]，此后大量相关研究陆续开展。2013年Paiva等[8]进一步研究了CPC表型、细胞遗传学和功能特征以及昼夜分布。结果表明，CPC代表了BM克隆浆细胞的一个独特亚群，其特征是整合素(CD11a/CD11c/CD29/CD49d/CD49e)、黏附(CD33/CD56/CD117/CD138)和激活分子(CD28/CD38/CD81)的下调。此外，将CPC与BM基质细胞共培养时，其大多处于静止状态，且具有较高的克隆发生潜能。MM病人每日外周血中CPC绝对数量有显著波动，在凌晨4:00～12:00达到峰值，下午16:00～24:00达到最低点。这表明在MM病人中，CPC 在休息期间可能会流出至外周血以定植/转移至除BM的其他部位。

3 CPC与MM关系

CPC的存在在单克隆免疫球蛋白疾病的各阶段都是高危标志，其对疾病进展风险具有预测作用。研究显示，外周血中CPC的存在与MGUS[9]和冒烟型骨髓瘤(smoldering multiple myeloma, SMM)[10]恶性转化为有症状MM的风险增加相关。Kumar等[9]对325例诊断为MGUS病人的外周血CPC进行了分析，结果显示与无CPC病人相比，有CPC病人进展为另一种浆细胞疾病(最常见的是MM)的可能性是前者2倍(OR=2.1,P=0.03)。Bianchi等[10]使用免疫荧光法对91例SMM病人外周血CPC进行检测，结果表明，伴有高水平CPC(定义为外周血浆细胞>5%)SMM病人在诊断后2～3年内进展风险增高。Gonsalves等[11]也对100例SMM病人外周血CPC通过流式细胞术进行评估，结果显示CPC的存在与更短的进展时间(time to progression，TTP)相关[10个月vs未达到(P<0.001)]。有研究表明，血液中CPC的数量从MGUS(CPC中位数为0.008/μL)到SMM(中位数为0.16/μL)和MM(中位数为1.9/μL)逐渐增加[12]。王晶等[13]对17例MM病人[髓外浆细胞瘤(extramedullary plasmacytoma,EMP)阴性者8例，EMP阳性者9例]采用流式细胞术对CPC进行检测，结果显示EMP阳性组CPC阳性率明显高于EMP阴性组(88.9%比25.0%，P=0.008)，这对病人是否有髓外转移具有重要的提示作用。

外周血中CPC可能与侵袭性生物学(较高的增殖率、较高的细胞遗传异常发生率和血管生成增加)相关[14]。CPC被认为是干细胞样肿瘤浆细胞，血液中CPC数量的增加可能会导致肿瘤更快、更广泛地扩散到整个BM及髓外部位，这就可以解释血液中较高的CPC计数与该病侵袭性特征之间的关联[12]。Nowakowski等[15]的研究也证实了上述观点。然而，Gonsalves等[16]认为CPC可能与肿瘤负荷存在正相关性。无论采用形态学还是流式细胞术方法，血液中CPC水平高的MM病人BM浆细胞比例都较高。未来还需要更大样本进一步验证CPC与肿瘤负荷确切的相关性。

3.1 新诊断多发性骨髓瘤(newly diagnosed multiple myeloma，NDMM) 在NDMM病人中，约75%的病人外周血中检测到CPC，CPC的数量被证明是整体生存的独立预测因子[15]。即使流式细胞术或免疫荧光检测到非常少的CPC，对于NDMM病人，其预后也较差[14]。Nowakowski等[15]研究结果表明，CPC>10个的病人中位总生存期(overall survival，OS)明显少于CPC<10个的病人(37.3个月比58.7个月,P=0.001)。在新药治疗时代，Gonsalves等[16]对157例NDMM病人(96%病人采用PIs/IMiDs为主的新药诱导治疗)的外周血CPC采用流式细胞术进行评估结果显示，CPC≥400个组和CPC<400个组病人的中位至下次治疗时间(time to next treatment，TTNT)分别为14个月和26个月(P<0.001)，2组对应的中位OS分别为32个月和未达到(P<0.001),且CPC≥400个组病人的国际分期系统(international staging system,ISS)分期、肌酐水平、浆细胞标记指数、骨髓浆细胞百分比、存在荧光原位杂交法(FISH)高危因素病人比例均高于CPC<400个组病人。在多变量分析中，CPC≥400个对OS及TTNT的负面影响均具有统计学意义。在新药时代，CPC的检测不仅可以评估NDMM病人预后，也可以预测自体造血干细胞移植(autologous stem cell transplantation，ASCT)后的早期复发[14]。Chakraborty等[17]分析了247例新药诱导治疗后早期行ASCT的NDMM病人，分别在诊断时和移植前用流式细胞术对其CPC进行评估。结果显示，诊断时CPC阳性的病人中，诱导治疗后CPC转阴与移植后无进展生存期(progression-free survival，PFS)和OS的显著改善有关。然而，与在诊断时和ASCT前没有检测到CPC的病人相比，他们的生存率仍然较低。移植后严格意义的完全缓解(stringent complete response，sCR)在CPC-/-组为32%，在CPC+/-组为30%，在CPC+/+或-/+组为12%(P=0.018)。ASCT后3组的中位PFS分别为30、24和14个月，5年总生存率分别为83%、70%和43%(P<0.001)。 Gonsalves等[18]的另一项研究对556例NDMM病人外周血CPC进行分析，将那些≥5 CPCs/μL且修订的国际分期系统(Revised International Staging System, R-ISS)Ⅰ期或Ⅱ期的病人重新分类为R-ISS ⅡB期。在诊断时，有、无CPC的病人中位TTNT和OS分别为25个月比43个月(P<0.001)和54个月比89个月(P<0.001)。诊断时≥5 CPCs/μL的病人，其TTNT和OS如下：R-ISS Ⅰ期为40个月和未达到； R-ISSⅡ期为30个月和72个月；R-ISSⅡB期为21个月和45个月，R-ISS Ⅲ为20个月和47个月。可见R-ISS ⅡB期的病人TNNT和OS与R-ISS Ⅲ期相似。由此表明，将CPC数量纳入目前R-ISS分期系统能使NDMM病人的预后评估更准确。

3.2 复发难治性多发性骨髓瘤(relapsed or refractory multiple myeloma，RRMM) 对于RRMM病人，复发后需要重新分层指导治疗。RRMM的不良预后包括初诊已经存在或新近获得的高危细胞遗传学异常、高β2微球蛋白和(或)低血清白蛋白(即ISS Ⅲ期)、异常乳酸脱氢酶、轻链或IgA型、肾功能不全和髓外疾病[19]。缓解时间短、进展快、既往治疗较多也是不良预后的预测因素[20]。Gonsalves等[21]将上述因素纳入647例接受连续治疗的RRMM病人中进行研究，采用流式细胞术对其外周血CPC进行评估。结果显示，CPC在完全缓解(complete response，CR)病人中均阴性。在疾病稳定(stable disease，SD)病人中，CPC的存在预示中位生存期较差(22个月比未达到;P=0.004)，在疾病进展(progressive disease, PD)病人中，CPC≥100个(流式细胞仪收集150 000个细胞时)预示生存期较差(12个月比33个月;P<0.001)。该研究强调CPC检测在疾病处于CR或SD病人中的重要性。Rawstron等[22]报道了治疗后CPC数量下降的趋势，RRMM的早期CPC状态可能具有预后价值，并有助于识别最终对挽救治疗有反应或失败的病人。RRMM病人在第一个治疗周期后CPC不降低可能有助于早期识别对该治疗有耐药性的病人[23]。目前对RRMM病人CPC的研究较少。

4 CPC作为新生标志物

CPC的临床意义及其随时可及性为疾病的诊断和评估带来了新视角，有望将CPC纳入新的危险分层标准，评估病情、指导治疗。Abe等[24]研究了PET-CT结合定量CPC对MM病人的预后价值。结果表明，除了肿瘤负荷外，这2个参数可能反映骨髓瘤略微不同的生物学特征，并且它们作为预后标记可能相互补充。PET-CT结合定量CPC系统的预后表现独立于高危的细胞遗传异常状态(CAs)或R-ISS(这是已知最强大的预后因素)，提示该系统可以用来补充和改进已建立的分层策略。未来对更多病人的CPC及其对应的骨髓浆细胞的横向、纵向基因组和免疫表型研究将进一步阐明其发病机制和在疾病进展中的作用。

由于CPC在MM病人外周血中数量较少，因此其检测一直是一个挑战。传统细胞学是检测MM病人血液中存在大量CPC的一种简便、快速的方法，但由于评估的有核细胞数量有限和它们的形态相似性，通常不能准确地将其从正常/反应浆细胞中区分出来，特别是在CPC数量较低的病人中。因此，免疫荧光显微技术随后被采用。它可以更灵敏、准确地评估MM病人血液中的CPC[9]。这项技术可以检测10 000个单核细胞中的1个克隆浆细胞(灵敏度为10-4)，从而提高了传统细胞学的灵敏度。但该技术存在灵敏度相对有限、费时费力、CPC纯度低等局限性，阻碍了其在许多实验室的常规应用[25]。流式细胞术作为一种简单、快速(<4 h)、经济和通用的方法，已被广泛用于鉴定、表征和计数MM病人血液中的CPC[25]。通过流式细胞仪可以识别出50%～75%NDMM病人中的CPC，具体取决于标记物和使用的特异性抗体组的数量，分析的细胞数以及样品制备方案[26]。但目前缺乏标准化的方案(抗体选择及每个样品分析的细胞数量的异质性)，检测CPC的灵敏度水平不稳定，以及对新鲜样品(<24～48 h)的需求也限制了结果的可重复性，也因此限制了其更广泛的用途和适用性。下一代流式细胞术(next-generation flow cytometry, NGF)与传统的流式细胞术(8～10色)相比，灵敏度和可重复性更高[27]。最近NGF也被用于检测MM病人血液中CPC[12]。近年来，Allele-specific oligonucleotide定量聚合酶链反应(ASO-qPCR)和下一代测序(next generation sequencing，NGS)等分子技术也应运而生。它们是用于检测和定量CPC的高特异性和灵敏性(<10-5～10-6)的分子方法[28]。与ASO-qPCR相比，NGS是一种更灵敏、适用度更广的分子技术。ASO-qPCR和NGS等分子技术不需要新鲜样品，因为它们可以使用存储的血液衍生核酸来评估CPC[29]。但其检测周期较长，无法及时反映CPC状态，且其对CPC及MM病人的相关性仍需进行大量研究。综上，流式细胞术是目前在临床及科研领域应用检测 CPC的最佳方法。

5 存在问题及展望

综上所述，CPC作为一个新的预后生物标志物，其存在与疾病进展、不良的细胞遗传学、较低的总生存率和较高的复发率有关，同时可预测侵袭性疾病进展，在评估NDMM和RRMM病人的预后中发挥着重要作用。有关CPC的生物学特征和病理生理机制有待进一步研究。