血管平滑肌细胞增殖在动脉粥样硬化中的研究进展

柳丽 黄菁菁 李晓庆 季军 周鹏 鲁翔 何慧薇

心血管疾病是全人类死亡的主要原因之一，来源于中动脉层的血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)增殖是形成动脉粥样硬化斑块的核心机制之一。在动脉粥样硬化形成过程中，VSMCs经历了复杂的结构和功能变化，产生不同的表型促进VSMCs的增殖[1]。VSMCs动态调节表型后增殖的能力促使其在控制血压、血液分布以及维持血管结构完整性方面发挥着重要作用，参与生理和病理性血管重塑。VSMCs增殖的调控过程极为复杂，包含多种调控分子和信号途径的共同作用，因此详细了解VSMCs的特征及其增殖过程对研究用于血管治疗的新药物至关重要。本文就VSMCs增殖在动脉粥样硬化中的研究进展及当前药物研究情况做一综述。

1 VSMCs增殖与动脉粥样硬化

在正常动脉中，VSMCs位于内侧层，负责动脉的收缩以及分泌细胞外基质(extracellular matrix, ECM)，并在维持动脉顺应性及弹性回弹中起重要作用。正常动脉中的VSMCs表达一系列“SMC标记”，通常包括平滑肌细胞肌球蛋白重链(MYH11)，SM22α/tagln、平滑肌细胞肌动蛋白(ACTA2)、平滑肌素等。在动脉粥样硬化血管中，VSMCs的这些标志物表达降低，反而获得了细胞增殖、迁移以及分泌各种ECM和细胞因子的能力。VSMCs是一种具有表型转化能力的细胞类型，在动脉粥样硬化前病变弥漫性内膜增厚(diffuse intimal thickening，DIT)时，VSMCs由中膜向内膜迁移，并在此过程中完成静止的“收缩”表型向激活的“合成”表型转化[2]。“合成”型VSMCs以收缩蛋白表达减少为特征，增强生长因子、受体以及ECM蛋白酶的表达，并由中膜向内膜迁移和增殖，有助于形成初始的动脉粥样硬化斑块。在晚期阶段，他们会进一步增殖聚集，形成纤维帽以稳定易碎斑块。早期的研究表明，VSMCs可以通过促进纤维帽形成，稳定动脉粥样硬化斑块，保护斑块不破裂，这被认为是个有益的作用。但近年来的研究表明，VSMCs似乎比预期更为多变，可以通过失去VSMCs特征变成泡沫细胞，并获得炎症细胞的特征。

在动脉粥样硬化过程中，VSMCs能向多个表型转化，包括钙化(成骨、软骨形成和破骨)和巨噬细胞表型。一方面，一些VSMCs在表型转化时获得巨噬细胞特性，分化为脂质负载的泡沫细胞样巨噬细胞，通过降低清除脂质、死亡细胞和坏死碎片的能力以及加剧炎症来促进动脉粥样硬化[3]。另一方面，VSMCs向钙化表型方面转化。VSMCs表型的可塑性和骨软骨分化在动脉粥样硬化性动脉内膜钙化中起关键作用[4]。动脉内膜钙化与动脉粥样硬化不良事件，如斑块破裂、心肌梗死、卒中等有重要关系。VSMCs通过调节表型促进细胞增殖，从而参与动脉粥样硬化全进程。

2 影响VSMCs增殖的主要因子及信号通路

影响VSMCs增殖最主要的因子是血小板衍生生长因子(platelet derived growth factor，PDGF)及其受体(platelet-derived growth factor receptor，PDGFR)。他们可通过影响多条下游信号通路来刺激VSMCs增殖，包括Ras/MAPK、磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶(Akt)等通路，这些信号通路均受蛋白酪氨酸磷酸酶负性调控。除此之外，成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，FGF)、表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)、胰岛素和膆岛素样生长因子1(IGF-1)也可以进一步刺激VSMCs的增殖。促进VSMCs增殖的活性物质包括：血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ, AngⅡ)和内皮素-1(endothelin 1, ET-1)、凝血酶、5-羟色胺(5-hydroxytryptamine, 5-HT)、整合素、环核苷酸磷酸二酯酶和端粒酶等。炎性细胞因子ILs、TNF-α、钙以及活性氧(reactive oxygen species, ROS)等,最终都将通过影响细胞周期进程调控VSMCs的增殖。

2.1 PDGFR及其相关信号通路

2.1.1 Ras/MAPK信号通路：以癌基因H-Ras, K-Ras以及N-Ras为主要代表的Ras家族成员可调节细胞转化、致瘤和转移，并与丝裂素活化蛋白激酶(MAPKs)细胞外信号调节蛋白激酶1/2(ERK1/2)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)和p38一起参与PDGFR的信号转导，并在VSMCs增殖中发挥了重要作用。以往研究表明，在血管损伤细胞模型和活体动物研究中，沉默H-Ras基因可以抑制大鼠颈动脉球囊损伤后内膜增厚[5]；雷公藤内酯醇可以使MAPK信号通路失活，抑制细胞周期蛋白p21和成视网膜母细胞瘤蛋白(retinoblastoma protein, RB)的表达，从而抑制VSMCs增殖[6]。

2.1.2 PI3K/Akt途径：PI3K通过激活蛋白激酶B(Akt)和蛋白激酶C(PKC)家族的一些成员调节VSMC增殖和迁移，并在血管损伤后促进新生内膜增生，使用PI3K或Akt抑制剂可以抑制VSMCs的增殖[7]。过表达的PKC-δ可以通过抑制细胞周期蛋白D1和E的表达来抑制VSMCs的增殖。研究表明，高水平的趋化素样因子1与G2/M期中VSMC的积累和少量凋亡的VSMC有关[8]，而Akt1si-RNA纳米粒子洗脱支架具有减轻支架内再狭窄的能力[9]。

2.1.3 磷脂酶C-γ(PLC-γ)途径：PLC-γ与PDGFR结合后被磷酸化并获得催化活性，是激活PDGFR信号转导的重要介质。PLC-γ催化二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)分解为肌醇-1,4,5-三磷酸(IP3)和二酰甘油(DAG)，进而通过调控胞内Ca2+和PKC活性激活下游信号。PKC的过度表达或磷酸肌醇依赖性蛋白激酶-1(PDK1)对内源性激酶的刺激作用可导致p21的降解，p21是细胞周期进程的抑制因子，从而促进细胞增殖。体外实验表明，PDGFR-β诱导的PLC-γ信号中断抑制了PDGF对VSMCs的分裂和趋化反应，促使小鼠因球囊损伤新生内膜形成减少[10]。

2.1.4 JAK/STAT途径：Janus激酶(JAKs)是一种通过JAK-STAT途径传递细胞外信号的非受体酪氨酸激酶。JAKs可能与G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors, GPCRs)、细胞内细胞因子受体[IL-6和干扰素-γ(IFN-γ)受体]的结构域有关。细胞因子受体与配体结合导致JAKs二聚体化、相互转磷酸化和活化，通过酪氨酸残基为信号转导和转录激活因子(STAT)蛋白提供对接位点。STATs在调控细胞周期进程中起着重要作用，在哺乳动物中，存在7种不同的STAT基因，他们的特征序列以及其组织特异性分布使特征反应成为可能。研究表明，STAT3通过上调细胞周期蛋白D2、D3和A，细胞分裂周期25A(CDC25A)以及下调细胞周期抑制剂p21和p27来刺激G1/S相转变。故沉默STAT3的表达可降低球囊损伤大鼠的VSMCs新生内膜增殖。内皮细胞中JAKs活性的负调控因子细胞因子信号传导抑制因子-3(SOCS-3)的过度表达，可抑制STAT3磷酸化及活化，从而抑制IL-6/IFN-γ介导的VSMCs的迁移和增殖[11]。

2.1.5 蛋白酪氨酸磷酸酶：蛋白酪氨酸磷酸酶是PDGFR及下游信号通路的负调节因子。胞浆低分子量磷酸酪氨酸蛋白磷酸酶(LMW-PTP)、T细胞蛋白酪氨酸磷酸酶(TC-PTP)和蛋白酪氨酸磷酸酶-1b(PTP-1B)均可使PDGFR去磷酸化。 Akt的活性由磷酸酶2A(PP2A)调节。磷酸酶和紧张素同源物(PTEN)是PI3K/Akt途径的负调控因子。有研究表明，在VSMCs中过度表达PTEN抑制了Ang Ⅱ诱导的细胞增殖和迁移。受体样磷酸酶密度增强磷酸酶-1(DEP-1)去磷酸化PDGFR，从而影响PLC-γ信号传导[12]。磷酸酶通过脱磷酸化STAT激活酪氨酸激酶直接或间接调节STAT活性。

2.2 FGF及其信号通路 FGF可以刺激VSMCs增殖。尽管酸性FGF和碱性FGF都能促进VSMCs的分裂，但大量研究表明，与酸性FGF相比，碱性FGF在血管发育和病理学中发挥着更重要的作用。FGF和PDGF有部分相同的信号通路，如Ras/MAPK的信号转导。全身注射抗碱性FGF的中和抗体可显著抑制球囊损伤大鼠VSMCs的增殖。

2.3 EGF及其信号通路 EGF家族由几种肽类生长因子组成，包括EGF、肝素结合表皮生长因子样生长因子、表调节素、β纤维蛋白、两性霉素和4种神经调节蛋白(NRG-1、2、3、4)，他们均具有刺激VSMCs增殖的作用。所有表皮生长因子受体(EGFR)配体均可促进VSMCs向增殖表型转化。此家族所有成员都必须被去整合素和金属蛋白酶蛋白裁切，才能具有生物活性。一些研究表明，表调节素是一种由AngⅡ、ET-1和凝血酶诱导的VSMCs分泌的促分裂素，他可能有助于VSMCs的增殖[13]。EGF家族成员与其同源受体结合以影响VSMCs的迁移和增殖。EGF和PDGF的共同信号通路，包括Ras/MAPK、PI3K/Akt、PLC-γ和JAK/STAT信号通路等。

2.4 AngⅡ及其相关信号通路 肾素-血管紧张素系统存在于全身和局部循环中，AngⅡ便来自于此，并发挥着收缩血管的重要作用。急性刺激AngⅡ可调节体内盐/水平衡、血管运动张力和血压，而慢性刺激可加速VSMCs的增殖和肥大，影响VSMCs的迁移和细胞外基质沉积，并导致心脏和血管重塑。大量研究表明，干扰AngⅡ的表达可抑制VSMCs的增殖。IOX1作为一种含有2AJumonji结构域(JMJD2A)的抑制因子，可通过选择性调控细胞周期相关蛋白D1和p21，抑制AngⅡ刺激的VSMCs增殖，IOX1因此被证明是可能治疗动脉粥样硬化的一种潜在的治疗剂[14]。

2.5 胰岛素和IGF-1信号通路 胰岛素是胰腺β细胞产生的一种激素，负责调节葡萄糖。IGF-1是一种与胰岛素同源的肽。在VSMCs中，这2种物质通过激活胰岛素受体(insulin receptor, IR)表现出类似的信号功能，随后将由4个(IRS-1、2、3、4)成员组成的胰岛素受体底物蛋白(IRS)磷酸化。IR有2种剪接异构体，他们通常在细胞中共同表达。这些细胞还表达高度相关的胰岛素样生长因子-1受体(IGF1R)，IGF1R也能被胰岛素激活。IRS-1和2可以激活2种主要的信号转导途径：PI3K/Akt和MAPK。许多研究表明，IGF-1/胰岛素相关途径刺激VSMCs增殖。IGF-1在VSMCs中的促分裂作用是通过IGF1R和PI3K介导的。PI3K/Akt、细胞内磷脂酶2(CPLA2)和ERK1/2在VSMCs增殖中也具有重要作用。此外，IGF1R在肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)诱导的VSMCs增殖中起重要作用。如反义寡核苷酸抑制TRAIL诱导的VSMCs增殖[15]。

2.6 非编码RNA(ncRNA)及其信号通路 非编码基因组通过调控基因编程和基因调控在心血管疾病中起着关键作用，如微小RNA(microRNA，miRNA)、小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)和长非编码RNA(long noncoding RNA, lncRNA)。miRNA是一类长度约为22个核苷酸的非编码RNA，通过抑制信使RNA(messenger RNA, mRNA)翻译或促进mRNA降解，从而在转录后水平调节基因表达。许多miRNA参与VSMCs的增殖调控[16]。miRNA-221和miRNA-222通过沉默靶蛋白CKI p27Kip1、p57Kip2和c-kit实现VSMCs的增殖。敲除miRNA-221或miRNA-222能够抑制大鼠颈动脉损伤后VSMCs的增殖和新内膜的形成[17]。 miRNA-22是VSMCs表型转换和血管新生内膜病变形成的新型调节剂，通过作用于其靶基因MECP2、HDAC4和EVI1来促进VSMCs收缩基因表达并抑制VSMCs的增殖和迁移[18]。lncRNA是长度大于 200 个核苷酸的非编码RNA，近年来发现lncRNA参与多种细胞信号通路，调控细胞分化、增殖、迁移和凋亡[19]，例如lncRNA HCG11通过靶向miR-144-3p/FOXF1轴促进动脉粥样硬化中VSMCs的增殖并抑制其凋亡[20]。lncRNA-H19可以通过lncRNA-H19/miR-148b/WNT/β-catenin轴促进VSMCs的增殖并抑制其凋亡，也可以通过miR-675/PTEN轴促进VSMCs的增殖[21]。

3 VSMCs增殖的调节剂

3.1 临床上用于抑制VSMCs的药物

3.1.1 紫杉醇：是从红豆杉中分离出来的一种天然二萜类化合物，是第一个被发现含有紫杉烷环的化合物，具有抗肿瘤活性[22]。紫杉醇是迄今为止已知的细胞分裂阻断剂，能通过稳定细胞来干扰有丝分裂微管的聚集，阻断有丝分裂纺锤体的解体，从而抑制有丝分裂活性。起初因紫杉醇不溶于水使其使用受限，后通过其衍生物10-脱乙酰基-巴卡亭Ⅲ解决了溶解度问题，使得紫杉醇广泛被用于洗脱支架。许多临床研究已经明确提出紫杉醇洗脱支架可以预防再狭窄[23]。目前正在研发的新制剂主要集中在纳米载体技术上。白蛋白结合型紫杉醇(Abraxane©)自2007年开始用于临床治疗，其他几种紫杉醇阳离子脂质体也已批准或正在进行临床试验的不同阶段。

3.1.2 雷帕霉素：早期研究发现雷帕霉素是一种具有抗真菌活性的化合物，随着研究的深入，研究人员发现雷帕霉素还具有免疫抑制和抗增殖活性的作用。雷帕霉素可阻断mTOR，通过丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶调节细胞增殖、生长及运动[24]。目前雷帕霉素衍生物(如依维莫司、佐他莫司)和生物可吸收聚合物是下一代支架研究的热点[25]。

3.2 体外实验中有效抑制VSMCs的天然产物 到目前为止，大量体外研究证实许多天然产物能有效抑制VSMCs增殖。如金丝桃苷、黄岑苷及红酒和葡萄皮中含有的白藜芦醇。研究表明：白藜芦醇可以抑制肺动脉高压小鼠模型中的心室肥大；金丝桃苷作为核受体Nur77的一种有效激活剂，对血管系统有积极影响[26]；天竺葵苷能显著抑制PDGF-BB诱导的迁移，降低局部黏着斑激酶(FAK)和FAK的磷酸化，减少F-肌动蛋白的表达，但不影响细胞增殖和FAK的磷酸化。黄岑苷是一种类黄酮化合物，在体外实验中黄岑苷通过miR-126-5p下调高迁移率族蛋白B1(HMGB1)的表达，显著抑制氧化LDL诱导的VSMCs增殖和迁移，从而抑制动脉粥样硬化的进展[27]。

4 结论

VSMCs的增殖受许多生长因子及其受体、血管活性物质、凝血因子、炎性因子、神经递质、ncRNA和其他分子的影响。这些因素和信号通路的相互作用最终形成了一个共同的调节途径——细胞周期。由于VSMCs的过度增殖是动脉粥样硬化、再狭窄和肺动脉高压等多种心血管疾病的病因，探寻抑制这一过程的方法具有极其重要的意义。尽管调控VSMCs增殖过程的机制很复杂，但最近三十来年的许多体外和体内研究说明VSMCs增殖是可被调控的，近些年也通过深入研究VSMCs的增殖机制寻找到一些心血管疾病治疗的新靶点。未来将有更多用于调节VSMCs增殖的新药物被用于治疗心血管疾病，这将为心血管疾病的药物治疗提供新的方向。