不同产蛋期蛋鸡卵巢组织差异表达基因的筛选与鉴定

段晓燕，刘 宇

(1.河北北方学院 教务处，河北 张家口 075000 2.河北北方学院实验动物中心，河北 张家口 075000)

卵巢是蛋鸡重要的生殖器官和内分泌腺，其发育程度直接关系着蛋鸡产蛋性能的优劣。随年龄变化，蛋鸡卵巢状况与产蛋性能直接相关[1]。同时，每个卵泡由卵泡卵囊层、颗粒层和卵母细胞周围的基质组成，而卵泡细胞的结构和数量在卵巢发育阶段有显著差异。研究发现，在不同产蛋周期，蛋鸡在经历了密集的新陈代谢后，不同组织与某些功能分子表达量的改变有关[2-3]。因此，筛选不同生长发育阶段蛋鸡卵巢组织的DEGs能够从分子层面帮助研究人员蛋鸡卵巢组织特征，进而能够分析影响蛋鸡繁殖性能的关键调节基因。 转录组学因其高通量、高灵敏性的优势可用来获取某物种细胞或组织的完整转录组数据，可以分析物种在不同条件下的基因表达变化[4]。基于此，本研究利用RNA-seq分析不同产蛋周期蛋鸡卵巢组织DEGs，以期为蛋鸡分子育种提供新的理论资料。

1 材料与方法

1.1 样品采集与文库构建

本研究以张家口地区饲养的京红蛋鸡为研究对象。100只蛋鸡按照标准饲养管理程序饲养，分别于5月龄(产蛋初期，产蛋率46%，LH_5M)，6月龄(产蛋高峰期，产蛋率93%，LH_6M)采集蛋鸡卵巢组织(各组n=3)。样品采集至无RNA酶EP管后立即投入液氮，运回实验室用于总RNA提取。总RNA采用trizol一步法提取，提取后采用Nanodrop检测浓度，以RIN值大于7作为提取成功的标准。选取10 μg检测合格的RNA，采用Epicentre Ribo-Zero Gold Kit (Illumina, San Diego, USA)去除核糖体RNA(rRNA)后随机打断为小片段，利用逆转录法合成cDNA文库，平均双末端文库长度为(300±50)bp。

1.2 转录组测序及序列比对

构建好的cDNA文库采用Illumina Hiseq 4000平台进行双末端测序(杭州联川)。对测序仪下机的原始数据(Raw Data)进行预处理，去除低质量片段。使用tophat[5]对Valid Data进行鸡参考基因组(Gallus_gallus_5.0)比对，统计相关信息。

1.3 基因表达分析及DEGs筛选与鉴定

用转录本组装软件StringTie[6]对reads进行组装和定量，基因表达量采用每百万测序碱基中每千个转录子测序碱基中所包含的测序片断数(Fragments Per Kilobase of exon model per Million mapped reads，FPKM)表示。DEGs的筛选采用R包Ballgown进行差异统计和可视化绘图，由于本研究所使用的样本含有生物学重复，因此DEGs的筛选标准为校正后的P值padj<0.05。根据样品基因表达谱的相近程度，将基因进行聚类分析，绘制热图。以log2(foldchange)为横坐标，-log10(pvalue)为纵坐标，对差异表达分析中所有的基因绘制火山图。根据生物学意义、引物表达量等信息选取5个DEGs，利用实时荧光定量(qRT-PCR)验证表达量差异性。引物采用Primer 5.0软件设计，详情见表1。以3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(GAPDH)作为内参。反应体系包括95 ℃ 3 min、95 ℃15 s以及60 ℃和72 ℃各30 s，共计40循环，熔解阶段由95 ℃ 30 s和60 ℃ 1 min组成，运用2-ΔΔCt法计算不同组别lncRNA的倍数变化，数据以差异倍数的log2 值(log2FoldChange)表示，使用SPSS26.0单因素方差分析进行分析，设定P<0.05为差异有计学意义。利用DAVID软件对筛选到的DEGs进行功能富集分析。采用ggplot2对GO富集分析结果和KEGG通路富集分析结果以散点图展示。

表1 引物信息

2 结果与分析

2.1 转录组测序结果

各组平均测序数据产出如表2所示，共得到 57.95Gb Clean Data，样品GC含量，Q30比值符合标准，表测序数据获取完整，可用于后续分析。参考基因组比对结果显示检测样品的Reads与参考基因组的平均比对效率在两个组分别为78.4%和76.90%，大部分转录本在参考基因组中均是唯一比对位置(大于67%)。

表2 转录组测序及序列比对结果

依据比对结果，大部分reads比对到外显子区域，其次为内含子区域，而基因间区域最少(图1)。此外，本研究对比对数据染色体分布进行了统计，结果显示染色体内部定位的reads总数与染色体大小呈正相关，1号染色体定位reads总数最多而W染色体最少。

图1 比对区域统计

2.2 基因表达分析

通过与参考基因组比对结果，本研究在5月龄和6月龄京红蛋鸡卵巢组织共筛查到39985个转录本表达，其中包含19586个蛋白质编码基因表达，其余转录本可能为新转录本或蛋白质编码基因可变剪接产物。本研究主要对蛋白质编码基因表达进行分析。各样本基因表达值分布统计如表3所示，基因FPKM大部分位于0.3～60之间，同组间样本重复性良好。以不同样本各自表达量处理后数值 log10(FPKM)做表达值密度图，各生物学重复样本的表达趋势趋于一致(图2)。

图2 基因表达密度分布

表3 各样本基因表达量分布统计

2.3 DEGs分析

以R语言的Ballgown包对StringTie组装和定量完毕的基因进行差异分析，采用矫正P值≤0.05作为阈值，共筛选到63个DEGs，其中52个在6月龄龄蛋鸡卵巢组织中高表达，11个在5月龄蛋鸡卵巢组织中高表达(图3A)。qRT-PCR结果显示出与RNA-seq结果一致的趋势(图3B)。研究发现DEGs较少，但表达量聚类分析热图显示DEGs仍可以反映两个转录组的区别(图3C)，但大量基因处于差异不显著状态。

图3 DEGs分析

2.4 DEGs功能富集分析

对DEGs的功能富集显示，63个DEGs显著富集到273条GO条目以及2条KEGG通路中。GO和KEGG分析可视化结果以散点图展示：Rich fac-tor表示位于该条目的差异基因个数/位于该条目的总基因数，Rich factor越大，富集程度越高(图4)。GO富集分析结果显示生物学功能方面富集在离子通道结合(ion channel binding, GO: 0044325)、糖酵解途径正调控(positive regulation of glycolytic process, GO:0045821)以及钾离子跨膜运输负向调节(negative regulation of potassium ion transmembrane transport, GO:1901380)；在细胞组分方面富集在Z膜(Z disc, GO:0030018)、细胞骨架(cytoskeleton, GO:0005856)及细胞外基质(extracellular matrix, GO:0031012)；在分子生物学途径方面富集在固醇转运ATP酶激活途径(sterol-transporting ATPase activity, GO:0034041)以及金属离子质子泵逆向转运途径(metal ion:proton antiporter activity, GO:0051139)。在KEGG通路富集分析方面，本研究仅发现DEGs显著富集在两条通路中，分别为焦点粘连途径(Focal adhesion)以及溶酶体途径(Lysosome)。

3 讨 论

蛋鸡的繁殖调控是一项复杂的生物学过程，涉及到不同分子的共同作用，通过基因互作，参与到不同的信号通路中[7-8]。本研究便是通过转录组测序手段检测不同生长发育阶段京红蛋鸡卵巢组织差异比到达基因，初步绘制了卵巢组织mRNA的表达谱，鉴定出部分与蛋鸡繁殖性能相关的关键基因。本研究发挥了转录组测序高通量的优点，在京红蛋鸡卵巢组织筛选到39985个转录本表达，其中包含19586个蛋白质编码基因表达，并对其染色体分布，基因表达量进行了分析。在本研究中，鉴定到了63个DEGs，尽管DEGs数目较少，但是某些高表达基因，可能在蛋鸡生长发育过程中发挥基础调节作用，其功能仍有待进一步研究。同时qRT-PCR技术也验证了RNA-seq的结果，提示RNA-seq在不同生物学过程的研究中可以发挥重要作用。

细胞外基质组分是维持细胞正常生态的重要成分，其对维持细胞环境稳态具有重要作用[9]。胶原蛋白是细胞外基质的主要成分之一，已有多个研究提示其不同类型胶原蛋白的含量变化与蛋鸡繁殖性能具有明显相关性[10]。在本研究筛选到的DEGs中，COL12A1，COL8A2在6月龄蛋鸡卵巢组织中高表达，其余胶原蛋白基因在两种卵巢组织中表达量差异不显著，但也表现出类似趋势。提示相关基因可能在蛋鸡生长发育过程种发挥重要作用。原肌球蛋白1基因(tropomyosin, TPM1)并且可通过竞争性结合gga-miR-449调控VEGF表达进而影响血管再生过程，而血管再生与类固醇激素合成在卵泡形成、排卵周期等方面发挥重要作用[11-12]。本研究中，TPM1基因在6月龄蛋鸡卵巢组织高表达，这与Li等[13]在海兰褐蛋鸡种的研究一致，提示TPM1可能通过调节相关基因表达影响蛋鸡产蛋性能。此外，有研究报道，IGFs、TGF-β、SF-1以及FOXL2等[14]基因可通过多种信号途径调节卵泡生成、成熟、细胞分化以及类固醇类激素合成。本研究发现IGF1基因在6月龄蛋鸡卵巢组织中上调表达，log2FoldChange=1.19。值得关注的是，应激相关基因HSPB7同样在6月龄蛋鸡卵巢组织高表达，而应激反应会诱导动物机体激素水平的变化，抑制蛋鸡雌激素介导的相关信号通路，影响蛋鸡蛋品质[15]，应激相关基因能否成为影响蛋鸡产蛋性能的靶标基因，还需要相关功能研究的验证。本研究内容，可为动物体抗应激的分子遗传机制的认识提供新的思路。

功能富集分析能够通过映射相关条目与通路，预测DEGs功能，为后续功能实验提供思路。本研究发现的显著富集GO通路有273条，涉及物质合成、能量代谢、细胞周期调控等多个生物学过程，提示DEGs可在不同过程中发挥作用，后续的功能验证可以围绕相关内容展开。而本研究仅发现DEGs富集在2条KEGG通路中，分别为焦点粘连途径以及溶酶体途径。尽管未达到显著富集程度，仍发现一些DEGs参与到影响蛋鸡繁殖性能的信号通路中，比如在6月龄蛋鸡卵巢组织中下调表达的PLIN2基因位于PPAR信号通路中，PPAR信号通路是经典脂代谢通路，调节脂肪酸代谢、脂质合成等途径[16]，研究结果提示蛋鸡在不同生长发育阶段可能存在脂质代谢合成的差异性，这也可能影响蛋鸡的产蛋性能。

4 结 论

本研究通过转录组学技术筛选了不同生长发育阶段蛋鸡卵巢组织DEGs，而这些DEGs参与了能量代谢、物质合成、氧化应激等多个生物学途径，研究内容反映了蛋鸡卵巢组织在不同阶段的差异性，同时为后续开展相关基因的功能研究以及蛋鸡分子育种提供理论资料。