搭载微混合芯片的食品内亚硝酸盐含量光电检测方法研究

庞浩然 - 解加庆 - 关其锋 - 孟晓宇 - 孙汝千 - 周福阳 -

(西北农林科技大学机械与电子工程学院，陕西 咸阳 712100)

亚硝酸盐是食品中常见的有害物质，广泛分布在腌制肉制品和泡菜内。蔬菜中硝酸盐因为细菌的生长也容易转化为亚硝酸盐，成人一次摄入亚硝酸盐含量>0.2 g即可引起中毒[1]，摄入量>3 g即有致死危险，此外，长期过量摄入亚硝酸盐还会大幅度增加致癌风险。目前，亚硝酸盐的检测方法有分光光度法、催化光度法、催化荧光法、离子色谱法、称量滴定法、高压离子色谱法等[2-3]，这些方法普遍存在检测成本高、预处理时间长、检测精度低、操作繁琐或设备庞大等缺陷。

亚硝酸盐可以使对氨基苯磺酸重氮化，产物遇到盐酸萘乙二胺时可生成紫红色偶氮染料。因此，可以配置相应检测试剂，对食品中亚硝酸盐进行定性检测。由于反应生成的紫红色偶氮染料性质稳定，通过精确检测反应物颜色变化，也可以实现亚硝酸盐浓度定量检测。基于以上原理，李新民等[4]制作了一种基于颜色检测的亚硝酸盐传感器，检测成本低，但检测周期设定为1 h，检测时间长。该传感器将数据上传到网络服务端，更适用于工业检测领域。Hou等[5]制备了一种基于纸基微流控芯片的亚硝酸盐检测仪，将拍摄的反应结果通过WiFi传输至自主开发的手机软件得出试验结果，实现了检测结果的远程输送，检测试剂使用减少且提高了检测精度。但其纸基微流控芯片需通过蜡印技术制备，且只能使用一次，检测成本较高。Thinikan等[6]基于蜂蜡制备了一种绿色环保的纸基微流控芯片，用于硝酸盐和亚硝酸盐的检测，亚硝酸盐和硝酸盐的检出限分别为0.1，0.4 mg/L。但该纸基芯片制备前，需先将CTAB与熔化的蜂蜡进行加热、均质化处理7 min，并冷却至室温。处理材料时间过长，不利于纸基微流控芯片的制备。肖良品等[7]制作了一种用于亚硝酸盐快速检测的三维纸质微流控芯片，基于纸基芯片的检测方法简单便用、稳定性好，但最低检测浓度还有待进一步降低。此外，检测结果的获取需先拍摄图片再使用软件分析，结果产生时间较长。综上，微流控芯片对于快速精准低成本的亚硝酸盐检测具有实践意义，并且纸基微流控芯片具备检测精度高、检测试剂少等优势，但仍存在检测成本高，检测预处理时间长等问题。

为实现食品中亚硝酸盐的高效灵敏快速检测，试验拟开发一种便携式、低成本、高精度的亚硝酸盐检测仪，采用高效混合微流控芯片进行进样混合反应，并利用自主搭建的光电检测系统测量亚硝酸盐浓度，为便携式亚硝酸盐浓度检测提供依据。

1 微混合芯片的设计与仿真

1.1 显色反应原理

亚硝酸盐含量的检测是基于格里斯试剂比色法原理[8]，其检测原理如图1所示。

图1 格里斯试剂比色法反应原理Figure 1 Principle of grice reagent colorimetry

1.2 混合微流控芯片设计与仿真

微混合芯片由于通道尺度小，可以大幅度降低检测样品的消耗[9]，降低检测成本。检测过程中反应溶液混合完全是保证检测精度和检测效率的重要前提，而微流控芯片入口处流体的流动属于层流，且雷诺数极低[10]。因此，为提高芯片的混合效率，通常设计具备缩扩和弯折微通道结构，将层流破坏为湍流，提高雷诺数。基于以上分析，设计混合微流控芯片三维结构(见图2)。芯片集成了溶液通入、混合、检测和流出功能，分为2个通道入口、1条混合通道、1个检测用蓄液池和1个通道出口4部分。通道入口1通入亚硝酸钠和对氨基苯磺酸的混合溶液，通道入口2通入盐酸萘乙二胺溶液，在混合通道中进行溶液混合，在蓄液池中完成显色反应，最终经通道出口流出。为方便封接和实现微量混合，将微流控芯片总尺寸设计为长75 mm，宽25 mm，高2 mm，通道截面尺寸为高500 μm，宽900 μm。此外，在微混合芯片的通道侧设计200 μm高的凸台，以保证芯片封接密闭性。

1. 通道入口 2. 凸台 3. 混合通道 4. 蓄液池 5. 胶合平面 6. 通道出口

为预测设计的芯片对检测试剂混合效果的影响，在制备芯片前先采用多场耦合软件COMSOL对反应液体在芯片通道内的混合过程进行有限元分析，以便预测混合通道对反应液的混合效果。仿真中引入蠕动流和稀物质传递耦合场分析，并采取静态隐式计算方法。流体的质量和动量传递机制采取描述不可压缩流体行为的Navier-Stokes方程进行模拟，其表达式为:

(1)

(2)

式中：

ρ——密度矢量；

ui、uj——流体的速度矢量；

学界好论朱子晚年之论，却不知象山也有晚年之论。晚年之象山一改中年之学风，内外兼修，再无偏颇之弊。须知晚年象山最大的两件事，一是要注经立说，二是要处理荆门军政，此两者皆侧重外王事业，可见其当时的心境与思想已有所转变。实则晚年陆九渊之学术思想已与朱子无大异，若能哲人多寿，自能会同一致。但以陆九渊晚年之生平与文献而言，已能见其会同之规模与梗要。

P——流体压力，N；

τij——应力张量，Pa。

质量通量由扩散和对流给出，其质量平衡方程可表达为:

(3)

式中：

c——反应液体浓度，mol/m3。

显色反应溶液中溶质的扩散率由扩散系数D决定[11]：

(4)

式中：

K——玻耳兹曼常数；

T——绝对温度，K；

μ——动态黏度，Pa·s；

r——分子半径，nm。

在所有参与显色反应的溶液中，盐酸萘乙二胺、对氨基苯磺酸和亚硝酸根的分子量大小分别为259.20，173.19，46.00。其中，盐酸萘乙二胺分子量最大，由扩散系数D可得其扩散率最低。因此，只要保证盐酸萘乙二胺在微流道截面内混合完全就可以确定所有参与反应的溶液、溶质在混合芯片通道内得到充分混合。混合指数是指芯片微流道不同截面上混合物扩散浓度最值的标准差，其计算式为[12]：

(5)

式中：

Ci——当前统计截面的盐酸萘乙二胺最值浓度，mol/L；

N——统计截面的选取浓度数量，mol/L；

由式(5)可知，截面浓度最值差距越小，混合指数越小，混合越均匀。对仿真得到的混合通道内盐酸萘乙二胺的混合指数进行分析，在混合通道水平截面上建立坐标系并选择截面，截面沿通道方向间隔2 mm，截面选择起点为混合通道起点，初始盐酸萘乙二胺浓度为518.4 mol/L，液体注射速度为1.67×10-5mol/m3。混合芯片内不同位置混合液浓度变化分布规律如图3所示，微通道截面上混合指数随微通道位置变化关系如图4所示，在该流速下混合芯片可以实现对反应液体的高效混合。

2 微流控芯片的制备与封接

为提高芯片的制备效率，降低制备成本，采用光固化3D打印机制备混合微流控芯片[13]。该打印机由平台、Z轴、材料槽、显示屏幕和LCD液晶屏幕组成。固化部件在固化过程中附着在平台上，Z轴控制平台运动，光敏树脂放置在材料槽内，光源的入射位置可以通过LCD液晶屏幕控制。为保证芯片的透光度，采用透明光敏树脂(中国深圳诺华智能科技有限公司)打印制备混合微流控芯片[14]。经调试后，打印机的打印参数如表1所示[15]。

图3 芯片微通道内盐酸萘乙二胺浓度分布云图

图4 微通道截面上混合指数随微通道位置变化关系

对打印出的芯片进行测试，将芯片沿通道截面切开，获取截面形状尺寸见图5，其通道宽度为516.8 μm，通道高度为882.1 μm，尺寸误差为1.29%，满足使用要求[16]。

使用α-氰基丙烯酸乙酯和75 mm×25 mm的载玻片对打印出的微混合芯片进行封接[17]。将α-氰基丙烯酸乙酯均匀涂抹在芯片表面的胶合平面，并将凸台和载玻片相互挤压。在压力的作用下，凸台结构与载玻片紧密结合，胶合平面上的α-氰基丙烯酸乙酯呈均匀分布，并且在空气中微量水蒸气的催化下发生加聚反应[18]，迅速固化而将被黏物粘牢。胶水和玻璃均具备优良的透光性，可以保证封接后芯片的光学特性。

表1 光固化工艺参数

图5 截面形状尺寸Figure 5 Section shape and size

3 光电检测系统的设计与搭建

采用自行搭建的光电检测系统对亚硝酸盐浓度进行定量检测[19-22]。光电检测系统包括LED恒定光源6、PVS精密电压源3、PCS恒流源驱动1和PDV探测器4(见图6)。为保证检测精度，系统外壳采取不透光的黑色树脂制备，整体密封以保证检测过程中无杂光影响。另外，LED恒定光源、混合微流控芯片蓄液池和PDV探测机探头位置需稳定处于同一条光路上。

LED恒定光源6由PCS恒定电流源1驱动，由PVS精密电压源3稳定电压，恒定光源通过微混合器2的蓄液池，经光线通路5被PDV探测器4探头接收，并输出电压值。亚硝酸盐浓度对蓄液池中显色反应的颜色变化深浅有影响，进而影响LED恒定光源输出至PDV探测器的光照强度，最终影响PDV探测器输出电压，根据输出电压和检测亚硝酸盐浓度的线性关系，可以实现由诱导电压对亚硝酸盐的精准检测。

4 亚硝酸盐浓度与诱导电压的对应关系

使用移液枪分别移取1 mL质量浓度为1 g/L的亚硝酸盐溶液，用等离子水分别稀释至0.05，0.10，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00，1.50，2.00 mg/L。分别取500 μL亚硝酸钠溶液与500 μL质量浓度为4 g/L的对氨基苯磺酸溶液混合，将混合溶液与1 000 μL质量浓度为2 g/L的盐酸萘乙二胺溶液分别从混合微流控芯片的两个入口通入，待其在蓄液池中反应3 min后，记录PDV探测器的输出电压值。

1. PCS恒流源驱动 2. 微混合器 3. PVS精密电压源 4. PDV探测器 5. 光线通路 6. LED恒定光源 7. 蓝牙模块

将亚硝酸盐浓度和对应的电压值进行拟合，得回归曲线表达式为y=4.532 2-0.143 9x，R2为0.996 7。

配置12份质量浓度为1 mg/L的亚硝酸盐溶液测量该光电检测仪的检出限，每次进样500 μL，所测结果分别为1.02，1.01，1.04，0.99，0.97，1.02，0.98，0.98，1.02，0.97，0.97，1.07，标准差为0.032 0，多次测量平均值为1.003 3 mg/L，检出限为0.095 7 mg/L，可满足日常便携检测要求[23-24]。

5 实际检测试验及数据分析

通过设计泡菜中亚硝酸盐浓度的检测试验，与分光光度法检测结果进行对比，验证该亚硝酸盐光电检测方法的可行性。

分别配置质量浓度为0.00，0.05，0.10，0.20，0.30，0.40，0.50，0.60，0.70，0.80，1.00，1.50，2.00，2.50 mg/L的亚硝酸盐标准溶液10 mL，使用分光光度计测量标准显色液在538 nm处的吸光值，将亚硝酸盐质量浓度和对应吸光值进行拟合，得线性关系表达式为y=0.410 6x+0.001 4，R2=0.999 5。

吸取5 mL泡菜澄清提取液于比色管中，分别加入2 mL质量浓度为4 g/L的对氨基苯磺酸溶液和质量浓度为2 g/L的盐酸萘乙二胺溶液，用蒸馏水定容至10 mL，混匀静置10 min。测得吸光值为0.515，经计算比色管中提取液的亚硝酸盐浓度为0.213 mg/L，泡菜样本中亚硝酸盐浓度为2.13 mg/L[25-27]。

取500 μL泡菜澄清提取液与500 μL质量浓度为4 g/L的对氨基苯磺酸溶液混合，将混合溶液与1 000 μL质量浓度为2 g/L的盐酸萘乙二胺分别从混合微流控芯片的两个入口通入，待其在蓄液池中混合3 min后，记录PDV探测器的输出电压值为4.467 V，根据亚硝酸盐含量与诱导电压关系曲线得泡菜澄清提取液中亚硝酸盐质量浓度为0.454 mg/L，泡菜中亚硝酸盐质量浓度为2.27 mg/L，与分光光度法检测结果的差值为0.14 mg/L，误差较小。因此，该搭载微混合芯片的光电检测仪可用作食品中亚硝酸盐浓度的定量快速检测。

6 结论

研究提供了一种搭载微混合芯片的食品中亚硝酸盐含量便携式光电检测方法，对食品中亚硝酸盐残留进行高精度的快速检测。通过光固化技术制备了满足尺寸要求的高混合效率的微混合芯片，并搭建了相应的光电检测系统。试验结果表明，基于微流控芯片的光电检测系统的最低检出限为0.095 7 mg/L，最快检出时间为3 min，可满足食品中亚硝酸盐的检测需求。研究中光电检测系统的检测电压值区间范围偏小，对检测精度产生不利影响，后续可对光电检测系统中的PDV探测器进行改进，以进一步提高探测精度。